Chromoblastomycosis: searching for experimental murine mode

This study was prompted by the lack of a satisfactory chronic infection animal model for studies of experimental chromoblastomycosis and the fact that very little is known about the infective fungal forms of Fonsecaea pedrosoi. First, we investigated the infective potential of different mycelial forms of F. pedrosoi, hyphae, conidia and conidiogenous cells, in BALB/c mice. The extent to which each structure could survive the host tissue response was found to vary. In vivo transformation of the fungal inoculum into muriform cells was only observed when the mice were infected with conidiogenous cells. Neutrophils appeared to play an important role in the control of F. pedrosoi, possibly by degranulating and releasing toxic products, while macrophages may be of greater importance in clearance. Fungal inoculation of a single site led to an inflammatory response accompanied by the formation of abscesses rich in phagocytes. The fungus was eliminated efficiently in up to two months. However, antigenic co-stimulation with viable and nonviable fungal cells in two different sites, such as the footpad (s.c.) and peritoneum, led to the formation of multifocal lesions rich in histiocytes and to prolonged F. pedrosoi infection in different strains of mice and knockout animals. Clinical and mycological cure in these animals generally occurred after 4 months. When the primary focus in the co-stimulated animals (an abscess rich in neutrophils) disappeared, neutrophil migration to the secondary site (active multifocal lesions) increased, culminating in the elimination of the fungi. These data support the hypothesis that multifocal infections show individual immune responses, while systemic resolution of lesions is coordinated as a whole. After the mucosae had been immunized and footpads had been infected with F. pedrosoi cells, infectious lesions were found to be more prolonged, indicating that antigen presentation at different sites may be involved in peripheral tolerance mechanisms. Although lesions in co-stimulated CD4 KO mice worsened during the initial period following inoculation with the fungus, the mice were found to control the infection later. Exacerbated inflammatory progression and a worsening of the infection were observed in co-stimulated CD8 KO animals. Lesions in co-stimulated KO mice had a similar pathologic profile, but IL-10 KO animals did not developed prolonged infection after co-stimulation. Co-stimulated xid mice developed chronic infection, showing that B1 cells may have an antagonistic effect on the immunosuppressive response. In another study, we selected the bacterial strain B. subtilis, which has known antagonistic properties against filamentous fungi, for use in interaction assays with the F. pedrosoi strain. The main cell changes observed after co-culture were the transformation of hyphae into arthroconidial forms and the production of terminal chlamydoconidia. The induction of synthesis of fungal melanin was also observed. Fungal cells from co-cultures were inoculated into mice. The chlamydoconidia from these co-cultures were more resistant in vivo to the actions of phagocytes. In the final experiment, we used axenic F. pedrosoi cultures that had been maintained for six months. Various fungal forms, such as round cells and terminal and intercalary chlamydoconidia, with cell walls made up of multiple layers, were found in aged cultures. When inoculated into BALB/c mice, these fungal forms produced chronic infection, primarily in the group of animals infected at two sites. Our findings show that the development of a satisfactory murine model of chromoblastomycosis depends on factors associated with the parasite and the host. Potentially infective fungal cells should preferably be used when developing experimental models, and immunosuppression mechanisms such as antigenic costimulation should be used as “auxiliary tools” to increase the likelihood of obtaining chronic lesions in healthy animals.A ausência de um modelo animal adequado de infecção crônica para estudo da cromoblastomicose experimental e o desconhecimento sobre as formas fúngicas infectantes de Fonsecaea pedrosoi estimularam a realização da presente investigação. Inicialmente, diferentes formas micelianas de F. pedrosoi, hifas, conídios e células conidiogênicas, foram testadas quanto ao seu potencial infectivo em camundongos BALB/c. Cada estrutura demonstrou capacidade distinta de sobrevida frente à resposta tecidual do hospedeiro. A transformação in vivo do inóculo fúngico para corpos escleróticos somente foi verificada nas infecções com células conidiogênicas. Neutrófilos parecem ser importantes no controle de F. pedrosoi, possivelmente pela degranulação e liberação de produtos tóxicos, enquanto macrófagos podem ser mais relevantes nos processos de clearance. A inoculação do fungo em único sítio produziu resposta inflamatória com formação de abscesso rico em fagócitos, ocorrendo eliminação da infecção em até dois meses. No entanto, coestímulo antigênico em dois sítios distintos, tais como pata s.c. e peritônio, respectivamente, com células fúngicas viáveis e inviáveis, nas diferentes linhagens de camundongos e animais knockouts, provocou a formação de lesões multifocais ricas em histiócitos e infecção persistente por F. pedrosoi, ocorrendo cura clínica e micológica desses animais, em geral, após 4 meses. Nos animais coestimulados, quando o foco primário (abscesso rico em neutrófilos) desaparecia, a migração de neutrófilos se intensificava para o sítio secundário (lesões focais ativas), culminando com a eliminação fúngica. Tais dados corroboraram para hipótese de atuação individualizada da resposta imune em focos múltiplos, porém com resolução, sistemicamente, coordenada das lesões. Após imunização das mucosas e infecção da pata com células de F. pedrosoi também foi verificada maior duração das lesões infecciosas, indicando que a apresentação antigênica de sítios distintos poderia estar envolvida com mecanismos tolerogênicos aos antígenos fúngicos. Camundongos CD4 KO que receberam duplo-estímulo, embora manifestassem agravamento das lesões nos períodos iniciais pós-inoculação fúngica, controlaram a infecção mais tardiamente. Progressão exarcebada e agravamento da infecção foram verificados em animais KO CD8 coestimulados. Camundongos co-estimulados apresentaram lesões com perfil anatomopatológico similar, no entanto, os animais IL-10 KO não desenvolveram infecção prolongada após coestimulação. Animais XID coestimulados desenvolveram infecção crônica, o que demonstrava a possibilidade das células B1 atuarem antagonicamente à resposta imunossupressora. Em outro estudo, selecionamos uma cepa bacteriana com propriedades antagônicas aos fungos filamentosos, identificada como B. subtilis, para ser utilizada em ensaios de interação com a cepa de F. pedrosoi. Em cocultivos, verificamos alterações celulares, como modificação das hifas para formas artroconidiadas, produção de clamidoconídios terminais e indução da síntese de melanina fúngica. Tais células cocultivadas foram inoculadas em camundongos, sendo os clamidoconídios terminais mais resistentes in vivo a ação dos fagócitos. No último experimento, utilizamos culturas axênicas de F. pedrosoi, mantidos em cultivos por seis meses. Formas fúngicas variadas, tais como células arredondadas, clamidoconídios terminais e intercalares, com parede celular composta por múltiplas camadas, foram analisadas por microscopia óptica e eletrônica. Essas células fúngicas foram inoculadas em camundongos BALB/c, produzindo infecção crônica, principalmente em grupo de animais infectados em dois sítios. Por fim, nossos achados evidenciaram que o desenvolvimento de um modelo murino adequado para cromoblastomicose depende de fatores ligados ao parasito e hospedeiro. Células fúngicas ou formas, potencialmente, infectantes devem ser utilizadas de modo preferencial no desenvolvimento dos modelos experimentais, devendo os mecanismos de imunossupressão, como a coestimulação antigênica, ser empregados como “ferramenta auxiliar” para ampliar as chances de sucesso na obtenção de lesões crônicas em animais hígidos.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT)CNPq: 14170/2004-9FAPEMAT: 002.138/2007TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe