Characterization of expression and function of recombinant follicle-stimulating receptors

The follicle stimulating hormone receptor (FSHR) is a member of a family of Gprotein-coupled receptors that has a large aminoterminal domain, rich in leucine repeats. The FSHR, together with the luteinizing hormone receptor, controls gonadal function in vertebrates. Mutations in the FSHR can alter its binding and signaling properties, and drastically affect reproductive function. To study the structure-function relation of this receptor, it is usually expressed in a heterologous system, because normally its levels are very low. Usually the recombinant protein is modified by insertion of a tag that is used to identify the protein. However, these tags and related manipulations can modify receptor function in ways that are poorly understood. Our aim was to study the effect of a few commonly used modifications. We examined the effect of 1) removal of the 5’ untranslated region (5’UTR), 2) the addition of a FLAG tag at the aminoterminal end, and 3) the addition of a GFP tag at the carboxyterminal end of the FSHR. We measured the effect of these modifications on several levels, including the production of mRNA, the production of the protein, its localization in the cell, and its ability to bind FSH and produce cAMP. Using classical PCR strategies, we prepared untagged receptors, FLAG-tagged receptors, and GFP-tagged receptors, each with and without a 5’UTR. The constructs were transiently transfected into HEK-293 cells. Removal of the 5’UTR reduced the production of cAMP induced by 0.1 and 1 μg/mL hFSH by about 40%. Binding of 125I-labeled hFSH was similarly reduced. Reduced production of cAMP was not due to reduced production of mRNA, as was shown by Northern blot analysis. However, fluorescence microscopy showed that tagged receptors that lacked the 5’UTR remained intracellular. Therefore, reduced receptor function of wild-type receptors that lack the 5’UTR is probably due to impaired insertion of the receptor in the cell membrane. Addition of a FLAG tag reduced the production of mRNA by about 60%, but did not interfere with the correct processing of the receptor and its insertion in the cell membrane as was shown by fluorescence microscopy. Binding ability of the FLAG-tagged receptor containing the 5’UTR was not altered, although the levels of cyclic AMP in response to hFSH were reduced by about 20% compared to wild-type receptors. Addition of a GFP epitope did not affect the production of mRNA, and did not seem to interfere with translation and post-translational modifications, because Western blots showed the presence of proteins with the size of both immature and mature FSHRs. However, the GFP tag severely reduced the insertion of the receptor in the cell membrane. As a result, GFP tagged receptors failed to bind FSH and produce cAMP. In conclusion, these commonly used receptor modifications altered protein function in several ways. A more detailed understanding of how the 5’UTR affects insertion of the protein in the cell membrane, how GFP interferes in this process, and how the FLAG epitope reduces mRNA production is not only of obvious practical significance, but can also help to understand the mechanisms involved in receptor expression and function.Os estudos de caracterização da função de GPCRs endógenos são dificultados pelo fato desses receptores serem naturalmente expressos em concentrações muito baixas. Em decorrência disso, a expressão de receptores recombinantes em sistemas heterólogos facilita a realização de estudos de caracterização. Apesar da adição de epítopos ter permitido grandes avanços ao estudo de receptores recombinantes expressos em sistemas heterólogos, é fundamental caracterizar a influência da modificação sobre a expressão e a função de receptores recombinantes. Como não existem dados na literatura a respeito do controle pós-transcricional do FSHR e os estudos a respeito do controle pós-traducional são escassos, o presente estudo procurou avaliar a influência da adição de epítopos e da extremidade 5’UTR sobre a transcrição, expressão e função do FSHR recombinante de rato. As seguintes etapas estiveram envolvidas: a) Obtenção de construções de cDNA codificando o FSHR contendo ou não parte (70 nucleotídeos) da extremidade 5’UTR, marcadas ou não pelos epítopos FLAG na região aminoterminal ou GFP na região carboxiterminal, por técnicas clássicas de PCR; b) Transfecção transiente das construções em células HEK-293; c) Caracterização funcional das proteínas recombinantes, por dosagem do AMPcíclico total produzido em resposta ao estímulo com FSH; d) Avaliação da transcrição gênica pelos níveis de RNA mensageiro obtidos para as construções, por Northern blot; e) Avaliação da expressão e localização das proteínas recombinantes, por ensaios de ligação do 125I-FSH, Western blot, ou microscopia de fluorescência. 1. Os estudos funcionais indicaram que: - a remoção da extremidade 5’UTR diminuiu a capacidade de ativação da produção de AMPcíclico da construção não marcada por epítopo; - a adição do epítopo FLAG também diminuiu a produção de AMPcíclico; - a remoção da extremidade 5’UTR da construção marcada com FLAG aboliu a função da construção; - a adição do epítopo GFP aboliu a função das construções, independentemente da presença da extremidade 5’UTR. Passamos, então, a estudar os diversos níveis de processamento das construções. 2. Os estudos de Northern blot nos revelaram que: - a remoção da extremidade 5’UTR praticamente não afetou ou elevou (no caso da construção (5’-) FLAG-FSHR) os níveis de expressão dos transcritos; - a adição do epítopo FLAG diminuiu os níveis do transcrito específico. - a adição do epítopo GFP não alterou os níveis do transcrito específico. Verificamos, portanto, que não houve correlação entre os níveis de RNA mensageiro e a função dos receptores, descartando a possibilidade de que possíveis alterações na transcrição gênica pudessem explicar a ausência de função das construções contendo GFP no carboxiterminal ou FLAG no aminoterminal sem a 5’UTR. Passamos a investigar se os RNAs mensageiros estariam levando à síntese das proteínas esperadas. Essa etapa foi estudada por ensaios de ligação com 125I-hFSH e/ou Western blot e/ou microscopia de fluorescência. 3. Os ensaios de ligação realizados em células intactas mostraram que: - a remoção da extremidade 5’UTR diminuiu a ligação em células intactas, transfectadas com a construção (5’-) FSHR, não marcada por epítopos; - a adição do epítopo FLAG na região aminoterminal praticamente não afetou a ligação de células intactas transfectadas com a construção (5’+) FLAG-FSHR. Porém, as que foram transfectadas com a construção (5’-) FLAG-FSHR não apresentaram ligação; - a adição da GFP na região carboxiterminal, independentemente de conterem ou não a extremidade 5’UTR, não apresentaram ligação específica. 4. Os experimentos de Western blot, realizados com lisados celulares obtidos a partir de células transfectadas com as construções conjugadas à GFP, mostraram a presença de duas formas protéicas de FSHR, madura e imatura. Esses resultados indicaram que a falta de função das construções contendo GFP no carboxiterminal não pode ser justificada pela ausência da expressão da proteína. A possibilidade que restava a ser investigada era a de que as proteínas não estivessem sendo inseridas adequadamente na membrana plasmática, o que impediria sua interação com o hormônio. Essa possibilidade foi analisada por microscopia de fluorescência. 5. Os experimentos realizados com microscopia de fluorescência demonstraram que: - as construções conjugadas à GFP levaram à expressão de proteínas que estão principalmente localizadas em compartimentos intracelulares. A co-localização do (5’-) FSHR-GFP com PDI demonstrou que essa construção fica principalmente retida no retículo endoplasmático. A construção (5’+) FSHR-GFP também levou a alguns pontos de expressão localizados no retículo endoplasmático, mas, principalmente, a uma distribuição intracelular mais difusa. - no caso da construção (5’-) FLAG-FSHR houve intensa marcação perinuclear em células permeabilizadas, e predominantemente de membrana para construção (5’+) FLAGFSHR. Este estudo destaca, portanto, a importância da escolha do epítopo e da sua localização, bem como da manipulação da extremidade 5’ UTR para a correta expressão e função do FSHR recombinante. Diante dos resultados obtidos é possível concluir que a adição do epítopo GFP na região carboxiterminal do FSHR aboliu a sua função e capacidade de ligação por impedir a sua correta expressão na membrana plasmática. Já a adição de um epítopo FLAG permitiu o correto processamento e inserção do receptor na membrana plasmática, de forma a preservar a capacidade de ligação e a função, embora níveis um pouco reduzidos de AMPcíclico tenham sido obtidos quando comparados ao receptor sem epítopo. Além disso, deve ser levado em consideração que a remoção da região 5’ não-traduzida pode afetar a expressão na membrana e, portanto, a função do FSHR, devendo ser analisada como potencial causadora de alterações da função do receptor em distúrbios da reprodução.TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe