Neue In-vitro-Ansätze für den Nachweis von akuter Neurotoxizität unter Verwendung neuartiger Technologien

Derzeit basieren neurotoxikologische Einstufungen von Chemikalien auf Verhaltens- und Neuropathologischen Untersuchungen. Obwohl diese Studien wissenschaftlich anerkannt sind, sind sie für eine Überprüfung von Chemikalien nicht geeigent. Um diese Einschränkungen zu überwinden, ist es notwendig, stufenweise aufgebaute Teststrategien, die auf in vitro-Systemen basieren, zu entwickeln und einzusetzen. Auf Grund der Komplexität des Nervensystems konnte bisher jedoch noch keine Einigkeit über das Design solcher Strategien erzielt werden.Die hier vorliegende Studie hatte zum Ziel, neue in vitro -Ansätze und Technologien für die neurotoxikologische Untersuchung von Chemikalien zu entwickeln. Insgesamt wurden drei in vitro-Systeme evaluiert und die Auswirkungen von Chemikalien auf die Mechanismen des Zelltodes (Apoptose), die spezifischen neuronalen Funktionen und die biochemischen Prozesse wurden bewertet.Durch die Einführung eines humanen Wildtyp (wt) p53-Gen in eine Pheochromocytom 12 (PC 12)-Zelllinie wurde ein in vitro-Testsystem entwickelt, um die p53 vermittelte Zelltoxizität zu erfassen.Westernblot-Analysen bestätigten eine kontrollierbare Expression des wt p53-Proteins.Zellen, die das p53-Protein überexprimieren, zeigten eine grössere Sensitivität gegenüber des Topoisomerase-I-Inhibitors Camptothecin, welcher p53 vermittelte Apoptose induziert, im Vergleich zu nicht überexprimierenden Zellen. Dadurch konnte der funktionelle Status des p53-Proteins bestätigt werden.Eine Überprüfung von 31 metallischen Verbindungen zeigte, dass p53 vermittelte Zelltoxizität durch metallische Verbindungen verursacht wurde, die für ihr krebserregendes Potenzial im Menschen bekannt sind.Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte PC12-Zelllinie ein geeignetes Testsystem ist, um p53 vermittelte Zelltoxizität festzustellen.Zweitens wurde ein Testsystem entwickelt, um frühe Effekte von Chemikalien auf neuronale Funktionen nachzuweisen. Das Testsystem basiert auf elektrophysiologischen Messungen der neuronalen Aktivität in brain-aggregates auf Multielektroden-Arrays (MEA). Wenn das System gut standardisiert ist, ist es in der Lage, Daten zu erheben, die in Übereinstimmung mit in vivo gefundenen Auswirkungen sind.Es konnte gezeigt werden, dass brain-aggregates in der Lage sind, induzierte Aktionspotentiale zu bilden und spontan neuronal zu feuern, was glutaminerge und GABAerge synaptische Übertragung erfordert. Dies konnte durch den Einsatz ihrer synaptischen A- und Antagonisten bestätigt werden.Behandlungen mit Trimethylzinnchlorid und Methylquecksilberchlorid, Ethanol und Paraoxon beeinträchtigten die neuronale Aktivität ohne Zelltoxizität hervorzurufen, was darauf schliessen lässt, dass Neurotoxizität vor der generellen Toxizität auftritt. Desweiteren waren die Ergebnisse der Studie in Übereinstimmung mit Daten, die in primären, dissoziierten oder Hippocampus-Kulturen erhoben wurden.Da eine einzige Isolation über 4000 funktionelle Kulturen hervorbringt, enthält diese Methode beide Vorteile der in vivo-ähnlichen Komplexität und einer hohen Durchlaufkapazität.Das entwickelte Testsystem zeigte elektrophysiologische Aktivitäten, die eine sensitive Erfassung von frühen Effekten auf die neuronale Funktion durch nervenspezifische Giftstoffe möglich machten.Drittens untersuchten wir, ob der metabolische fingerprint der behandelten Zellen benutzt werden könnte, um Neurotoxizität zu bestimmen. Die Kombination von brain-aggregates und Massenspektrometrie, ist dazu geeignet, eine reichhaltige Einsicht in komplexe biologische Systeme zu gewähren und könnte deshalb wertvolle biochemische Endpunkte für eine neurotoxikologische Einstufung liefern.Behandlung mit Methylquecksilber Chlorid und Caffein rief konzentrationsabhängig metabolische Veränderungen hervor, beginnend in noch nicht zelltoxischen Konzentrationen.Veränderungen, hervorgerufen durch Methylquecksilberchlorid und Koffein wurden als γ-Aminobuttersäure, Cholin, Glutamin, Kreatin, Spermin identifiziert und somit als mögliche Biomarker für diese Auswirkungen erkannt.Biomarkerintensitäten im Stoffwechselprofil zeigten konzentrations-abhängige Veränderungen, die in Übereinstimmung mit dem hypothetischen Mechanismus der Neurotoxizität und der Neuroprotektion sind.Die Untersuchung von acht Chemikalien mit Toxizität für Leber, Nieren und Gehirn zeigten Zielorgan-abhängige metabolische Störungen, darauf hindeutend, dass das Potenzial dieser Methode darin liegt, neurotoxikologische Substanzen zu identifizieren.Insgesamt zeigte der Gebrauch von Metabolomics ein grosses Potenzial, um Neurotoxizität festzustellen und neue Biomarker zu entdecken.Zusammenfassend demonstriert diese Studie die Nützlichkeit der Kombination von Zellkulturmethoden und neuen Technologien, um relevante in vitro-Ansätze zur Feststellung von Neurotoxizität zu kreieren. Ihre biologische Komplexizität, ihr Umfang und ihre Effizienz machen sie relevant, um in Teststrategien integriert zu werden