Molecular and cytogenetic analysis of bivalve species with commercial interest

Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e TecnológicaA classe Bivalvia é um dos maiores, mais diversificado e importante grupo no reino animal, apresentando um elevado número de espécies marinhas, com grande importância económica e ecológica, que estão sujeitas a sobreexploração e degradação ambiental. A investigação genética em bivalves marinhos, permite obter informações essenciais para estimar a sua biodiversidade, dado indispensável para estabelecimento de medidas de conservação, especialmente relevante no caso de espécies exploradas comercialmente; e igualmente para contribuir para melhorar a classificação taxonómica e relações filogenéticas. O principal objetivo desta tese foi a caracterização de genomas, utilizando técnicas moleculares e citogenéticas, de espécies com importância comercial, pertencentes às famílias: Veneridae (Bivalvia, Heterodonta) e Ostreidae (Bivalvia, Pteriomorphia). O uso de marcadores moleculares, RAPDs, permitiu determinar e analisar a variabilidade genética encontrada em duas populações da espécie Veneridae - Ruditapes decussatus. A diversidade genética intra-populacional estimada em cada uma das populações foi elevada, enquanto a diferenciação genética entre as populações apresentou valores muito baixos. Foi igualmente destacado que esta homogeneidade genética encontrada nas populações é causada por atividades antropogénicas. A caracterização genética de populações de bivalves é importante para o estabelecimento de políticas de gestão dos recursos marinhos, quer para programas de repovoamento quer para efeitos comerciais como aquicultura. No caso das populações estudadas seria a população da Ria Formosa, nas duas espécies, a indicada para ser utilizada em ambos tipos de programa. A introdução de técnicas moleculares mais precisas, como a hibridização in situ por fluorescência (FISH), tem permitido o desenvolvimento dos estudos de citogenética molecular em bivalves, possibilitando, de forma inequívoca a identificação individual dos cromossomas e o mapeamento genético, contribuindo para a clarificação das relações filogenéticas e estudos sobre rearranjos cromossómicos numa grande variedade de organismos. A aplicação de técnicas de citogenética molecular, neste estudo, permitiu caracterizar e mapear sequências repetitivas [genes ribossomais (18S-5.8S-28S e 5S); sequência telomérica ((TTAGGG)n)], no genoma de ostras (O. edulis e O. stentina) e amêijoas (C. gallina). A localização cromossómica das sequências repetitivas permitiu criar padrões de marcação cromossómica característicos de cada uma das espécies estudadas. Este estudo permitiu igualmente o isolamento, caracterização e hibridação de uma nova família de DNA satélite em cromossomas de C. gallina. A sequencia de DNA satélite apresenta um monómero de repetição ~170 bp. A hibridação in situ desta sequência revelou que a sequência esta localizada em alguns cromossomas – distribuída nas regiões terminais, centroméricas e (peri)centromericas – mas também em pelos menos três pares de cromossomas não foi visível qualquer sinal de hibridação. Um dos resultados mais pertinentes deste trabalho foi a contribuição para a clarificação da taxonomia da subfamília Ostreinae (Harry, 1985). Os dados citogenéticos obtidos apoiam, de facto, de forma clara uma reorganização taxonomica na subfamília Ostreinae (Harry, 1985). O trabalho aqui apresentado permitiu um conhecimento mais aprofundado das características (cito)genéticas de espécies de bivalves marinhos de interesse comercial. Os dados obtidos permitiram contribuir para a clarificação taxonómica das famílias estudadas, assim como o estabelecimento de relações filogenéticas entre elas, e em último caso pretende ser o ponto de partida para o estudo da evolução do genoma em bivalves. Os resultados obtidos poderão contribuir igualmente, e de um ponto de vista de aplicação mais pratica e comercial, a programas de monitorização ambiental, apoio ao melhoramento, produção e comercialização destas espécies.The class Bivalvia is one of the largest, most diverse and important groups in the animal kingdom, with a high number of marine species with high economic and ecological importance, which are subject to over exploration and habitat degradation. Genetic research in marine bivalves can provide essential information to access their biodiversity, indispensable to establish conservation measurements, especially in commercially exploited species, but also contribute to improve the taxonomy classification and phylogenetic relationships. The main goal of this thesis was the characterization of the genome of marine bivalves with commercial importance, belonging to the Veneridae (Bivalvia, Heterodonta) and Ostreidae (Bivalvia, Pteriomorphia) families, using molecular and cytogenetic techniques. The use of molecular markers, (like) RAPDs, allowed to determine and analyse the genetic variation of the entire genome of different populations of one Veneridae specie - Ruditapes decussatus. The two populations presented a high degree of genetic variability within populations and low level of genetic differentiation among them, being the genetic homogeneity found in these populations caused by anthropogenic activities. The genetic information allowed the selection of a preferential population, Ria Formosa, to be used as broodstock for aquaculture purposes and for subsequent restocking programs.. Molecular cytogenetic studies in bivalves have greatly increased through the years, mainly due to the introduction of more accurate molecular techniques, like Fluorescent in situ hybridization (FISH). FISH allows the unequivocal identification of chromosomes in a karyotype and gene mapping, allowing the clarification of taxonomic and phylogenetic relationships and studies on chromosome rearrangement in a large variety of organisms. Through the application of FISH, we characterized and mapped repetitive sequences [Major (18S-5.8S-28S) and minor (5S) rDNA genes and telomeric sequence ((TTAGGG)n)], in oysters (O. edulis and O. stentina) and clams (C. gallina) genomes. The chromosomal location of these repetitive sequences has provided chromosomal markers that allow the accurate identification in the studied species, and consequently, the study of chromosome evolution of bivalves. The isolation, characterization and physical location of a new satellite DNA family to chromosomes of C. gallina was also performed. The sequence is composed by repeat monomers with a length ~170 bp. This sequence hybridize in blocks in some chromosome pairs - distribution varied between subterminal, terminal, centromeric and (peri)centromeric regions -, and at least in 3 chromosome pairs no hybridization signals were observed. One of the major results of this work, was the contribution to the clarification of the taxonomic incongruence of the subfamily Ostreinae (Harry, 1985). Our cytogenetic data, strongly supports the taxonomic reorganization of the subfamily Ostreinae (Harry, 1985). The work presented allowed a comprehensive knowledge of the (cyto)genetic characteristics of marine bivalve species of commercial interest. The data obtained allowed to clarify taxonomic incongruences, study phylogenetic relationships and can be considered an important contribution for the study of genome evolution in bivalves. From a more practical and commercial point view, these data can also contribute to more specific applications, in terms of environmental monitoring, production and commercialization of these species.Fundação para a Ciência e a Tecnologia, “Programa Operacional Potencial Humano - POPH”, co-financiado pelo Fundo Social Europeu (POPH/FSE) e por fundos nacionais (POPH-QREN