Avaliação histopatológica e imunohistoquímica da implantação subcutânea de membrana de colagénio em ratos diabéticos

Dissertação de Mestrado em BioquímicaA diabetes mellitus é uma doença complexa e potencialmente debilitante, que afeta milhões de indivíduos em todo o mundo e é já considerada um problema de saúde pública pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A diabetes tipo 1 é caraterizada pela destruição autoimune das células β pancreáticas dos ilhéus de Langerhans e a diabetes tipo 2 pela resistência periférica à insulina levando ao desenvolvimento da hiperglicemia. A hiperglicemia crónica afeta negativamente a regeneração e remodelação óssea, atrasando assim, a cicatrização óssea e aumentando a suscetibilidade de doenças periodontais. Deste modo, na regeneração guiada de tecidos, é necessária a utilização de um biomaterial adequado que promova a regeneração tecidular em condições diabéticas. Neste estudo, avaliou-se a biocompatibilidade in vivo de uma membrana de colagénio num modelo animal diabético, particularmente, a reação inflamatória aguda (48 h) e crónica (3 semanas) após implantação subcutânea. Neste trabalho foram utilizados 14 ratos machos da estirpe Wistar, divididos em 4 grupos: Controlo (n=3) e Diabetes (n=3) 48h e Controlo (n=3) e Diabetes (n=5) 3 semanas. A condição diabética foi introduzida através da administração intraperitoneal de 50 mg/kg de estreptozotocina (STZ). Foi realizada uma cirurgia no dorso dos animais onde foi efetuada a implantação subcutânea de membranas de colagénio. Um grupo controlo e um grupo com animais diabéticos foram sacrificados 48 horas após a implantação do biomaterial, e os animais dos restantes grupos foram sacrificados 3 semanas após a implantação. Foram recolhidas amostras de pele dos locais de implantação que foram avaliadas por histopatologia, com contagem total e diferencial das células inflamatórias, através da coloração de hematoxilina e eosina (H&E). Para caracterizar o infiltrado inflamatório linfocitário, foi efetuada a técnica de imunohistoquímica (IHQ) com os anticorpos CD3, BLA e CD79. Observamos que o número total de células inflamatórias foi superior nos animais controlo, sendo esta diferença mais acentuada às 48h após implantação. Relativamente à contagem diferencial, verificou-se que às 48h se observa uma maior percentagem de neutrófilos, enquanto nos grupos sacrificados às 3 semanas se obteve uma percentagem superior de linfócitos e macrófagos. Relativamente aos resultados obtidos na IHQ, os animais controlo apresentaram maior percentagem de linfócitos marcados com CD3 (linfócitos T) e menor percentagem de linfócitos marcados com BLA e CD79 (linfócitos B), do que os animais diabéticos. A membrana de colagénio demonstrou ser bastante biocompatível, apresentando uma resposta inflamatória moderada às 3 semanas. Os grupos diabéticos (48h e 3 semanas) apresentaram diferenças na resposta inflamatória em relação aos grupos controlo, nomeadamente no que se refere ao número de células e à sua tipologia. O STZ administrado para induzir a diabetes possui um efeito imunossupressor que pode estar na origem do menor número de células inflamatórias nos animais diabéticos. Ainda não são claros os mecanismos subjacentes ao tipo celular presente no infiltrado inflamatório após implantação da membrana de colagénio em condições diabéticas. No entanto, é possível que a hiperglicemia possa estar na origem do menor número de linfócitos T observado na condição diabética, não afetando a presença de linfócitos B. Deste modo, a diminuição da resposta imune em condições diabéticas pode estar associada fundamentalmente a uma diminuição dos linfócitos T.Diabetes mellitus is a complex and potentially debilitating disease that affects millions of individuals worldwide and it is considered a public health problem by the World Health Organization (WHO). Type 1 diabetes is characterized by autoimmune destruction of pancreatic β cells of the islets of Langerhans, and type 2 diabetes by peripheral insulin resistance leading to the development of hyperglycemia. Chronic hyperglycemia negatively affects bone remodeling and regeneration, delaying bone healing and increasing the susceptibility of periodontal diseases. Therefore, in guided tissue regeneration, the use of a suitable material that promotes tissue regeneration in diabetic conditions is required. In this study, we evaluated the in vivo biocompatibility of a collagen membrane in a diabetic animal model, particularly the acute (48 hours) and chronic (3 weeks) inflammatory reaction after subcutaneous implantation. In this study, 14 male Wistar rats were used, divided into four groups: Control (n=3) and Diabetes (n=3) 48h and Control (n=3) and Diabetes (n=5) 3 weeks. The diabetic condition was introduced via intraperitoneal administration of 50 mg/kg of streptozotocin (STZ). A surgery was performed on the back of the animals, where the implantation of collagen membranes was subcutaneously performed. A control group and one group of diabetic animals were sacrificed 48 hours after the implantation of the biomaterial and the other two groups were sacrificed 3 weeks after implantation. Skin samples of the implantation sites were collected and evaluated by histopathology, with total and differential counts of inflammatory cells, after staining with hematoxylin and eosin (H&E). To characterize the lymphocytic inflammatory infiltrate, immunohistochemistry (IHC) was performed with CD3, CD79 and BLA antibodies. The total number of inflammatory cells was higher in the control animals, with a more evident difference at 48h after implantation. Regarding the differential counts, it was found that at 48h a higher percentage of neutrophils was present, while in the animals sacrificed at 3 weeks, a higher percentage of lymphocytes and macrophages was observed. Regarding the results obtained in IHC, control animals showed a higher percentage of CD3-positive lymphocytes (T lymphocytes) and a lower percentage of BLA and CD79-positive lymphocytes (B lymphocytes) than diabetic animals. The collagen membrane was shown to be highly biocompatible, having a moderate inflammatory response at 3 weeks post implantation. The diabetic groups (48 hours and 3 weeks) showed differences in the inflammatory response compared to control groups, in particular regarding the number of inflammatory cells and their type. STZ has an immunosuppressive effect that may be associated with fewer inflammatory cells in the diabetic animals. The mechanisms underlying cell type presence in the inflammatory infiltrate in diabetic conditions are not yet clear. However, it is possible that hyperglycemia can cause the smaller number of T lymphocytes observed in the diabetic condition, without affecting the presence of B lymphocytes. Therefore, the decrease of the immune response in diabetic conditions might be mainly associated with a decrease in T lymphocytes