Molecular pharming in Lactuca sativa L. (Lettuce) : development of protocols

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-empreendedorismo de Plantas Aromáticas e MedicinaisAgrobacterium tumefaciens- mediated genetic transformation is an indispensable tool used for the production of genetically modified plants. In our laboratory, we have established a transformation system for lettuce (Lactuca sativa L.) cultivars Batávia Blonde, Butterhead and Queen of May, using Agrobacterium strain EHA 105. Five-day-old mature cotyledon explants was used for transformation study. The selection of transformed shoots was carried out in MS medium fortified with BA (0.1 mg L), NAA (0.1 mg/L) and under the selection of Kanamycin sulphate (50 to BB and 100mg/L to BH and QM) and Ticarcillin (250 mg/L). The transient GUS expression assay was carried out in order to find transformed shoots and to asses the influence of the genotype in the infection process. No differences were found between varieties in the T-DNA transfer rate (100%), but it was observed different behaviours during the regeneration process. Thus, it was shown that the genotype influences the response of different varieties during regeneration but not influences the predisposition to infection by A. tumefaciens. The molecular confirmation by PCR and Southern blot of transformed shoots revealed the foreign gene integration into lettuce genome. The reporter gene show a segregation pattern of Mendel in lettuce, since the generations T1 and T2 had a segregation ration of 3:1. It was proven that the gene gusA has no influence in the phenolic profile of the plants, since no differences were found in the type of compounds produced between transgenic plants and non-transgenic. Having established the protocol for infection of L. sativa L., in an attempt to demonstrate the applicability of this method, it was constructed an expression vector for an animal protein, leukaemia inhibitor factor (LIF), wich has not yet been expressed in plants. The construction of this vector will allow the expression of LIF in plants like lettuce and future studies on LIF yield production and purification in systems like plants. In this way will be possible to compare the different methods to produce LIF and select the ideal.Transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens- é uma ferramenta indispensável na produção de plantas geneticamente modificadas. O presente estudo foi efectuado de forma a estabelecer um sistema de transformação eficiente para diferentes variedades de alface (Batávia Blonde, Butterhead e Queen of May), usando a estirpe de Agrobacterium EHA105. Cotilédones com cinco dias de idade foram usados no estudo de transformação. A selecção dos rebentos caulinares desenvolvidos foi efectuado em meio basal MS suplementado com BA e NAA a 0.1 mg/L e sobre a selecção de canamicina a 50mg/L para Batávia Blonde e 100mg/L para Butterhead e Queen of May e ticarcilina a 250mg/L. A expressão do gene gusA foi realizada para detectar rebentos transformados e verificar a influência do genótipo no processo de infecção. Não foram detectadas diferenças entre as variedades no que diz respeito à percentagem de transferência de T-DNA (100%). Pelo contrário foram detectadas diferenças entre as variedades no processo de regeneração. Isto demonstra que o genótipo exerce influência na resposta das diferentes variedades no processo regenerativo mas não tem influência na prédisposição das plantas para a infecção por Agrobacterium. A confirmação da integração do gene no genoma foi feita por análise de PCR e Southern blot. O gene repórter demonstrou que na alface transformada houve segregação do gene segundo Mendel, já que as gerações T1 e T2 apresentaram segregação 3:1. Foi provado que o gene gusA não exerceu influência no perfil fenólico das plantas já que não foram observadas diferenças significativas entre planas transgénicas e não transgénicas. Uma vez estabelecido um protocolo de infecção de L. sativa L., de forma a demonstrar a aplicabilidade do método, foi construído um vector de expressão para a proteína animal Leukaemia inhibitory factor (LIF), proteína que ainda não foi expressa em plantas. A construção deste vector permitirá a expressão de LIF em plantas como a alface e permitirá a realização de futuros estudos relativamente ao rendimento da produção da proteína e purificação. Desta forma será possível comparar os diferentes métodos para a produção de LIF e seleccionar o ideal