Diet in the promotion or prevention of colorectal cancer

Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e AmbientalColorectal cancer incidence is highly associated with one’s lifestyle, such as lack of physical activity, which leads to obesity, smoking habits, and most importantly, diet. Diet is an important risk factor for colon carcinogenesis and several studies have shown that high red meat and saturated fat intake increases the incidence of this disease significantly. On the other hand, a healthy balanced diet with intake of fruits and vegetables can decrease the risk of this disease. Dietary strategies for colon cancer chemoprevention, and even during treatment, are needed to help reduce the incidence of colorectal cancer. The aim of this work was to investigate dietary compounds that can be used in these dietary strategies for colon cancer prevention. Also, we initiated the development of new models to be used for compound screening processes. Initially, we focused on the effects of two bile acids, deoxycholic acid (DCA), with colon cancer promoting capacity, and ursodeoxycholic acid (UDCA), a chemopreventive compound, induced in Caco-2 cell line. We found that DCA in fact increase DNA damage and apoptosis in Caco-2 cell line. Also, activation of MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways was also observed. UDCA did not induce DNA damage, but did induce the same act ivation in the signaling pathways. So, it seems that DCA increase cell turnover by increasing apoptosis and also cell proliferation in the remaining cells. UDCA only increase cell proliferation. When UDCA was administered as a pretreatment before DCA treatment, apoptosis was increased and this increase was accompanied by a constant activation of the JNK signaling pathway. Also, pretreatment with UDCA significantly decreased expression of the repair proteins MGMT and MLH1. One of the aims of this work was to develop an in vitro model of the in vivo azoxymethane (AOM)-induced colon cancer model. With the conditions tested we were able to induce a slight increase in cell proliferation in Caco-2 cells. This increase of cell proliferation could possibly be explained by the activation of the MAPK/ERK pathway, which was also activated with AOM treatment. Although we observed this increase in cell proliferation, we found no induction of O6-methylguanine lesions by our CoMeth assay or DNA damage observed by the comet assay. In the in vivo assays, the potential of an herbal tea, sage, and two isolated compounds found in foods from our diet, ursolic acid (UA) and EGCG, were evaluated for their chemopreventive effects against colorectal cancer. In the first study, sage tea was given to Fischer 344 rats before or after AOM treatment. Sage tea was able to reduce the number of pre-neoplastic lesions when given before AOM treatment, demonstrating chemopreventive potential. This reduction of pre-neoplastic lesions was accompanied by a reduction of the number of proliferating cells in colon crypts, as seen by Ki67 marker. Also, it conferred protection against DNA damage induced by AOM and by H2O2 ex vivo in colonocytes and lymphocytes. In the second study, UA and EGCG were added to the diet of healthy Fischer 344 rats. The potential of these compounds to protect against DNA damage was assessed. We found that both compounds protected against endogenous DNA damage in colonocytes and lymphocytes. The effects of the two compounds on protection against alkylating DNA damage induced ex vivo was also evaluated. UA and EGCG conferred protection against this type of damage in colonocytes, but not in lymphocytes. Finally, it has been shown that epigenetics has an important role in colon carcinogenesis, so we tried to develop a new, simple method to evaluate demethylating agents. We used the CoMeth assay developed in our group in a MMR-deficient cell line, in which one of the intervenients, MLH1, is epigenetically silenced by hypermethylation. Using 5-azacytidine, we were able to revert the hypermethylation and induce DNA damage in these cells. We further characterized the model, showing increase in apoptosis, and effects on reexpression of MLH1 protein levels by western blot. We also tested a few natural compounds with the model and found that EGCG, which is well-known that it has demethylating ability, induced similar levels of DNA damage as 5-azacitidine, suggesting that the model is functional. In conclusion, this work demonstrated the potential of sage tea as a chemopreventive agent and UA and EGCG as compounds with interest for chemopreventive strategies. The AOM in vitro model needs to be improved, but the adapted CoMeth assay for demethylating compounds is functional. Altogether, but with some additional studies, these natural compounds could be considered as chemopreventive agents and have possible interest in dietary strategies for cancer prevention.A incidência do cancro colorectal está altamente relacionada com o estilo de vida das pessoas. A falta de exercício, hábitos de tabagismo, obesidade e a dieta são alguns fatores de risco. A dieta assume um papel importante na carcinogénese do cólon. Vários estudos demonstraram que dietas ricas em carnes vermelhas e gorduras saturadas aumentam significativamente a incidência desta doença. No entanto, o seu risco de aparecimento pode ser reduzido com uma dieta saudável, rica em frutas e vegetais. Estratégias de quimioprevenção do cancro do cólon baseadas na dieta, assim como no decorrer do seu tratamento, são necessárias para ajudar na redução da sua incidência. Com este trabalho, pretendeu-se avaliar a capacidade preventiva de compostos presentes na dieta no aparecimento do cancro do cólon. Foi, também, desenvolvido trabalho no sentido de desenvolver novos modelos que possam ser usados no screening de outros compostos. Inicialmente, o trabalho focou-se no estudo da resposta da linha celular Caco-2 à presença de dois ácidos biliares, o ácido deoxicólico (DCA), um promotor do cancro do cólon, e o ácido ursodesoxicólico (UDCA), um composto quimiopreventivo. Descobriu-se que o DCA induz o aumento de danos no DNA, assim como promove a apoptose na linha celular. Verificou-se, também, a ativação das vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/AKT. No caso do UDCA, observou-se uma ativação das mesmas vias de sinalização, no entanto, não houve um aumento nos danos do DNA. Desta forma, o DCA aparenta ser capaz de aumentar a renovação celular, visto que promove a apoptose e também a proliferação celular. O UDCA é apenas capaz de aumentar a proliferação celular. Quando o UDCA foi administrado como prétratamento ao tratamento com DCA, verificou-se um aumento da apoptose, o qual foi acompanhado de uma ativação constante da via de sinalização JNK. O pré-tratamento com UDCA foi, também, responsável por uma redução significativa da expressão das enzimas de reparação MGMT e MLH1. Com este trabalho, também se pretendeu desenvolver um modelo in vitro do modelo in vivo de indução do cancro do cólon com azoximetano (AOM). As condições usadas permitiram induzir um ligeiro aumento da proliferação celular. Este aumento da proliferação pode ser explicado pela ativação da via de sinalização MAPK/ERK, a qual também foi ativada pelo tratamento com AOM. Apesar do aumento observado da proliferação celular, não se identificaram danos do tipo O6-metilguanina, recorrendo ao método CoMeth, nem danos no DNA, observados por comet assay. Nos estudos in vivo, avaliou-se o potencial quimiopreventivo do chá de Sálvia e de dois compostos isolados presentes na dieta, o ácido ursólico (UA) e o (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG), contra o cancro colorectal,. No primeiro estudo, ratos Fischer 344 consumiram chá de Sálvia antes ou após o tratamento com AOM. O chá foi capaz de reduzir o número de lesões pré-neoplásicas quando administrado antes do tratamento com AOM, demonstrando o seu potencial quimiopreventivo. Essa redução de lesões pré-neoplásicas foi acompanhada duma redução do número de células proliferativas nas criptas do cólon, observado com o marcador Ki67. Foi, também, observada proteção do DNA contra danos induzidos por AOM e por H2O2 em ensaios ex vivo com colonócitos e linfócitos. No segundo estudo, incluiu-se UA e EGCG na dieta de ratos Fischer 344 saudáveis, avaliando-se o seu potencial protetor contra danos de DNA. Os resultados mostraram que, em colonócitos e linfócitos, ambos os compostos conferem proteção contra danos endógenos do DNA. O seu potencial contra danos alquilantes induzidos no DNA foi, também, avaliado em ensaios ex vivo. Nos colonócitos, foi possível observar proteção conferida pelo UA e pelo EGCG contra este tipo de danos, ao contrário do observado no caso dos linfócitos. Por fim, uma vez que a epigenética assume um papel importante na carcinogénese do cólon, criou-se um método novo, e simples, para avaliação de agentes desmetilantes. O método CoMeth, desenvolvido do nosso grupo de investigação, foi usado numa linha celular deficiente no sistema de Mismatch repair (MMR), na qual o gene MLH1 se encontra epigeneticamente silenciado por hipermetilação. Usado a 5-azacitidina, foi possível reverter a hipermetilação e induzir danos no DNA nestas células. Foi, também, observado um aumento da apoptose e, pela técnica de western blot, percebeu-se que existe reexpressão da proteína MLH1. Vários compostos naturais foram usados para validar o método e, entre eles, o EGCG, que é conhecido pela sua capacidade de desmetilação, induziu níveis de danos no DNA semelhantes àqueles observados com a 5-azacitidina, validando a funcionalidade do método. Assim, este trabalho comprovou não só o potencial quimiopreventivo do chá de Sálvia mas também o potencial do UA e do EGCG como parte integrante duma estratégia quimiopreventiva. O método CoMeth provou ser funcional na avaliação de potenciais agentes desmetilantes, contudo, o modelo in vitro do AOM precisa de ser melhorado. No seu conjunto, apesar de ser necessário completar os estudos já realizados, os compostos naturais estudados podem ser considerados agentes quimiopreventivos, conferindo-lhes o potencial para aplicação em estratégicas de prevenção de cancro baseadas na dieta.Fundação para a Ciência e a Tecnologia bolsa SFRH/BD/64817/2009