Entwicklung eines Plasmids zur Expression von SOCS-3 in Hepatozyten

Entzündungsvorgänge spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Entstehung und der Aufrechterhaltung malignen Wachstums. Besonders IL-6 und seine Signalübertragung mittels der JAK-STAT-3 Kaskade sind in vielen Tumorentitäten dysreguliert. Der hierbei vermehrt aktivierte Transkriptionsfaktor STAT-3 nimmt eine Schlüsselrolle ein bei der Vermittlung maligner Eigenschaften wie Apoptoseresistenz und gesteigerte Proliferation. SOCS-3 ist ein natürlicher Inhibitor dieses Signalwegs. Eine Methylierung seiner Genregion und damit eine verringerte Aktivität dieses Proteins konnte unter anderem im hepatozellulären Karzinom nachgewiesen werden. Erhöhte SOCS-3 Konzentrationen führen zu reduziertem Wachstum und verstärkter Apoptose von Tumorzellen. Die vorliegende Promotion hat das Ziel, ein Plasmid mit leberzellspezifischer SOCS-3 Expression herzustellen und dessen Funktionalität in vitro nachzuweisen. Dies kann in Folge dazu dienen, die Funktion von SOCS-3 bei der Entstehung des HCC zu entschlüsseln und mögliche therapeutische Ansätze aufzuzeigen. Das SOCS-3 Gen wurde mittels einer PCR vervielfältigt und dieser DNA Abschnitt in einen CMV Promoter tragenden Vektor überführt. Die Vollständigkeit und Expression von der Genregion und damit die Funktionalität des Plasmids konnte durch Gensequenzanalyse und Westernblot verifiziert werden. Der anschließende Austausch der Promoterregion führt zur Spezifität des Vektorproteins bezüglich Leberzellen, da nur in diesen der Albumin Promoter aktiviert wird. Damit transfizierte HepG2 und Hepa 1-6 Zellen zeigen im Westernblot im Gegensatz zu nativen Zellen deutlich erhöhte SOCS-3 Proteinmengen. Als Funktionsanalyse des modifizierten Vektors fungierten nach Stimulation mit IL-6 ein pSTAT-3 Westernblot und eine pSTAT-3 Bindungskapazitätsmessung. Eine nach Stimulation gemessene erniedrigte pSTAT-3 Proteinmenge und eine verringerte pSTAT-3 Bindungskapazität in mit dem hergestellten Plasmid transfizierten Zellen entsprechen der erwarteten Wirkung vermehrt vorliegenden SOCS-3, das als natürlicher Inhibitor des JAK-STAT-3 Signalweges wirkt. Die Wirkung von SOCS-3 über die molekulare Ebene hinaus konnte im Vergleich der DNA Synthese und damit der Proliferation der Zellen gezeigt werden. Das Wachstum mit dem SOCS-3 tragenden Vektor transfizierter Zellen nach IL-6 Stimulation ist im Vergleich zu nativen Zellen deutlich verringert. Der proliferative Effekt von IL-6 und dessen nachfolgendem Signalweg über STAT-3 kann durch vermehrte SOCS-3 Expression effektiv gehemmt werden. Mit Vorliegen dieses Vektors können weiterführende in vivo Experimente durchgeführt werden, die die Rolle und den Einfluss von SOCS-3 auf Lebertumormodelle in Mäusen untersuchen. Dies trägt nicht nur zum Verständnis der Vorgänge auf molekularer Ebene jener malignen Erkrankung bei, sondern kann mögliche therapeutische Ansätze aufzeigen