Design stabiler und katalytisch aktiver (beta, alpha)8-Barrel-Enzyme durch Rekombination von (beta, alpha)4-Halbbarrel-Domänen

In der vorliegenden Dissertation wurde die molekulare Evolution neuer (beta/alpha)8-Barrel Enzyme durch die Rekombination von existierenden (beta/alpha)4-Halbbarreln experimentell untersucht. Dieser Arbeit liegt das Modell zugrunde, wonach die Vielfalt heutiger (beta/alpha)8-Barrel Enzyme durch eine Reihe von Duplikationen, Fusionen und Rekombinationen aus einem gemeinsamen Vorfahren halber Länge - dem (beta/alpha)4-Halbbarrel � entstanden ist. In bisherigen Arbeiten konnte durch Duplikation und Fusion eines (beta/alpha)4-Halbbarrels und anschließender Optimierung der Kontaktfläche ein stabiles (beta/alpha)8-Barrel Enzym hergestellt werden. Um auch den Mechanismus der Genrekombination experimentell nachzuvollziehen, wurden aus den (beta/alpha)8-Barrel Enzymen ProFAR Isomerase (HisA) und Imidazolglycerinphosphat Synthase (HisF) aus Thermotoga maritima chimäre Proteine hergestellt. Dazu wurde das N-terminale (beta/alpha)4-Halbbarrel von HisA mit dem C-terminalen (beta/alpha)4-Halbbarrel von HisF zu HisAF kombiniert, sowie in analoger Weise HisFA erzeugt. Biophysikalische Charakterisierungen der Chimären im Vorfeld dieser Arbeit deuteten darauf hin, dass es sich insbesondere bei HisAF um ein kompaktes Protein mit definierter Struktur handelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nunmehr katalytische Aktivität auf HisAF etabliert werden. Da für die Etablierung katalytischer Aktivität auf HisAF keine hoch aufgelöste Struktur zur Verfügung stand, wurde dazu ein Ansatz der gerichteten Evolution gewählt. Auf den Elternenzymen HisA und HisF konnte bereits schwache PRA-Isomerase (TrpF) Aktivität etabliert werden, weswegen dies ebenfalls für HisAF versucht wurde. Dazu wurden Zellen eines trpF-Deletionsstammes (deltatrpF) mit einer durch fehlerbehaftete PCR hergestellten hisAF-Genbank transformiert und mittels in vivo Komplementation in festem bzw. flüssigem Minimalmedium ohne Tryptophan auf aktive Varianten selektiert. Vier der komplementierenden HisAF-Varianten, die zwischen 1�5 Aminosäureaustausche trugen, wurden exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Die rekombinanten Proteine zeigten schwache TrpF-Aktivität in vitro (kcat/KMPRA = 0,1�6,8 mM-1min-1), die jedoch durch die gezielte Kombination von Austauschen schrittweise um mehrere Größenordnungen verbessert werden konnte. Die beste Variante HisAFcomIII, die insgesamt sieben Aminosäureaustausche enthält, weist einen kcat/KMPRA von 1425 mM-1min-1 auf. Während die Wechselzahl mit 4 min-1 etwa 50-fach unterhalb der wildtypischer TrpF Enzyme liegt, entsprechen die Werte für die Michaeliskonstante (KMPRA = 2,9 µM) und die Dissoziationskonstante für die Bindung eines Produktanalogons (KdrCdRP = 5,6 µM) weitgehend den entsprechenden Werten für TrpF aus E. coli. Die Herstellung weiterer Genbanken auf der Basis von HisAFcomIII führte zur Isolierung schneller komplementierender Varianten, deren TrpF-Aktivität in vitro jedoch nur unwesentlich erhöht war. Vermutlich geht die verbesserte in vivo Aktivität dieser Proteine auf eine erhöhte konformationelle Stabilität zurück. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden ausgewählte Mutationen, die bei der Selektion auf TrpF-Aktivität von HisAF gefunden wurden, in die Elternenzyme HisA und HisF übertragen. Die bereits früher gefundene geringe TrpF-Aktivität von HisF-D130V konnte dadurch nur geringfügig verbessert werden. Hingegen führte in der früher charakterisierten HisA-H75Y+F111S+D127V Variante der zusätzliche Austausch D169V zu einer drastischen Erhöhung der Aktivität auf kcat/KMPRA = 4335 mM-1min-1. Besonders bemerkenswert ist, dass die Wechselzahl dieses Proteins mit 67 min-1 etwa 30 % des Wertes für TrpF aus T. maritima erreicht und höher liegt als die Wechselzahl von wildtypischem HisA für die native HisA-Reaktion. In Kooperation mit Dr. Birte Höcker wurde diese HisA-Variante kristallisiert und ihre Röntgenstruktur mit einer Auflösung von 1,8 Å aufgeklärt. Derzeit wird PRA in das aktive Zentrum des Proteins modelliert, um die mechanistischen Grundlagen für die hohe TrpF-Aktivität zu verstehen. Insgesamt unterstützen die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse die Hypothese, dass es im Verlauf der Evolution der (beta/alpha)8-Barrel Enzyme zur Rekombination von (beta/alpha)4-Halbbarreln gekommen ist. Sie zeigen weiterhin, dass sich das (beta/alpha)8-Barrel Proteingerüst zur de novo Etablierung wildtypähnlicher enzymatischer Aktivität eignet