Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor 1 (TNF-R1)-Internalisierung

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Funktion der TNF-R1-Internalisierung. Dazu sollte das für die Internalisierung notwendige Aminosäuremotiv identifiziert werden. In unserer Arbeitsgruppe konnte durch in vitro-Mutagenese eine zytoplasmatische Domäne des TNF-R1 gefunden werden, nach deren Deletion die Internalisierung des TNF-R1 blockiert ist. Dieser als TRID (TNF-R1 internalization domain) bezeichnete Bereich enthält das kanonische Internalisierungsmotiv YXXPhi. Um zu prüfen, ob YXXPhi für die Internalisierung des TNF-R1 verantwortlich ist, wurden TNF-R1-Konstrukte hergestellt, denen entweder die TRID fehlte oder deren YXXPhi-Motiv mutiert worden war. Anschließend wurden die TNF-R1-Konstrukte in TNF-R1/TNF-R2-defizienten Zellen stabil zur Expression gebracht. Die Mutation des YXXF-Motivs resultierte ebenso wie eine Deletion der gesamten TRID in einer vollständigen Blockierung der TNF-R1-Internalisierung. Diese Ergebnisse zeigten klar, dass YXXPhi das für die TNF-R1-Internalisierung essentielle Aminosäuremotiv darstellt. Bisherige Studien zeigten, dass eine pharmakologische Blockierung der TNF-R1-Internalisierung die TNF-induzierte Apoptose inhibiert. Der TNF-R1 vermittelt Apoptose durch Rekrutierung eines DISC (death inducing signaling complex) aus den Proteinen TRADD, FADD und Caspase-8 an die intrazelluläre Todesdomäne. Mit Hilfe der hergestellten Zellen, die internalisierungsdefiziente TNF-Rezeptoren exprimierten, sollte der Einfluss der TNF-R1-Internalisierung auf die Bildung des DISC näher untersucht werden. Dabei stellte sich das Problem, dass in allen bisherigen Studien die DISC-Rekrutierung unter physiologischen Bedingungen nicht nachgewiesen werden konnte. Daher wurden in dieser Arbeit durch eine eigens hierfür entwickelte Apparatur immunomagnetische TNF-R1-Vesikel nach Stimulation mit TNF isoliert und analysiert. Durch diesen neuen methodischen Ansatz konnte zum ersten Mal die Rekrutierung des DISC an den TNF-R1 unter physiologischen Bedingungen bewiesen werden. Darüber hinaus wurde anhand der internalisierungsdefizienten TNF-R1-Konstrukte gezeigt, dass die Blockierung der TNF-R1-Internalisierung zu einem Ausbleiben des DISC führt und damit die Voraussetzung zur Apoptoseinduktion verhindert. Es wurde jedoch festgestellt, dass Zellen mit internalisierungsdefizienten TNF-Rezeptoren auf TNF hypersensitiv reagieren. In den entsprechenden TNF-Zytotoxizitätstests waren die Zellen mit einem Proteinsynthesehemmer vorbehandelt worden. Parallel durchgeführte Versuche in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass eine TNF-R1-Internalisierungsdefizienz Zellen in Abwesenheit eines Proteinsynthesehemmers vor TNF schützt. Unter den Bedingungen der TNF-R1-Internalisierungsdefizienz und gleichzeitiger Verwendung eines Proteinsynthesehemmers war also Apoptoseinduktion trotz einer fehlenden DISC-Rekrutierung möglich. Am wahrscheinlichsten erschien eine Apoptoseinduktion durch eine erhöhte Aktivität des Enzyms N-SMase, da dieses durch den TNF-R1 aktiviert werden kann und proapoptotische Ceramide erzeugt. Diese Hypothese wurde durch die Feststellung einer hohen N-SMase-Aktivität in Zellen mit internalisierungsdefizienten TNF-Rezeptoren belegt. Daher wurde ein TNF-R1-Konstrukt hergestellt, das weder die TRID noch die Domäne zur N-SMase-Aktivierung besaß. Zellen mit diesem TNF-R1 waren gegenüber TNF resistent und zeigten eine geringe N-SMase-Aktivität. Somit konnte gezeigt werden, dass die TNF-R1-Internalisierung die Voraussetzung für die DISC-vermittelte Apoptose darstellt. Weiterhin wurde eine alternative Apoptoseinduktion durch Aktivierung der N-SMase gefunden, für die aber ein internalisierungsdefizienter TNF-R1 und die Verwendung eines Proteinsynthesehemmers Voraussetzung waren. Nachdem gezeigt wurde, dass die TNF-R1-Internalisierung für die TNF-induzierte Apoptose essentiell ist, sollte untersucht werden, welche Rolle die TNF-R1-Internalisierung in der Zellbiologie spielen könnte. Das in der E3-Region des adenoviralen Genoms kodierte Protein E3-14.7K ist in Mauszellen ein Inhibitor der TNF-induzierten Apoptose. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass die Expression von E3-14.K in Mauszellen zur TNF-Resistenz aufgrund einer Blockierung der TNF-R1-Internalisierung und eines Ausbleibens der DISC-Rekrutierung führt. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass in humane Zellen E3-14.7K ebenfalls TNF-Resistenz vermittelt und dies, wie in murinen Zellen, auf einer Blockierung der TNF-R1-Internalisierung beruht. Dieser Resistenzmechanismus wurde sowohl in E3-14.7K-transduzierten Zellen als auch unter den pathophysiologischen Bedingungen einer Virusinfektion gefunden. Weiterhin zeigten die Experimente mit infizierten Zellen entgegen bisherigen Studien, dass E3-14.7K als einziges E3-kodiertes Protein vor TNF-induzierter Apoptose schützt