Identification of ribonuclease potentially associated with double stranded RNA (dsRNA) degradation in Tuta absoluta (Meyrick) and efficiency in gene silencing induced by RNA interference (RNAi)

A traça-do-tomateiro Tuta absoluta Meyrick (Lepidoptera: Gelechiidae), nativa da América do Sul, é uma praga importante da família Solanaceae e uma das pragas economicamente mais devastadoras do tomateiro (Solanum lycopersicum) no mundo. Foi identificada no Brasil na década de 1980 e invadiu a Europa em 2006, onde se alastrou por importantes regiões produtoras de tomate, causando grandes prejuízos. Sua principal forma de controle consiste na utilização de inseticidas químicos, porém o uso indiscriminado desses produtos tem levado a perda de eficácia e a resistência de T. absoluta tem sido relatada. Portanto, a busca por formas alternativas de controle desse inseto-praga se faz necessária e a utilização da técnica de RNAi (RNA interferente) tem se demonstrado como alternativa de grande potencial para o controle de T. absoluta. O RNAi consiste em um mecanismo de regulação pós-transcricional em nível de mRNA, levando ao silenciamento gênico desencadeado após a exposição a moléculas de RNA fita dupla (dsRNA). Contudo, é conhecido que a utilização dessa técnica apresenta variação entre as ordens e espécies de insetos, e a ordem Lepidoptera tem sido apontada como recalcitrante ao silenciamento gênico via RNAi. Nesse sentido, nucleases presentes no lumen do intestino dos insetos com a capacidade de degração de dsRNA têm sido apontadas como possível mecanismo associado à recalcitrância dessa ordem ao RNAi. Recentemente, foi descrita a nuclease RNAi efficiency related nucleasse (REase) que está presente no intestino médio de insetos da ordem Lepidoptera e que são capazes de digerir moléculas de dsRNA antes que sejam processadas pela enzima Dicer, afetando assim a eficiência do RNAi. Sendo assim, esse trabalho teve como objetivo a busca em transcriptoma de T. absoluta por ribonucleases como a recém descoberta REase e a investigação de sua relação com a eficiência do uso da técnica de RNAi nesse inseto-praga. Após a busca de sequências, foram identificados cinco contigs dos quais três continham o domínio PIN característico e após análises filogenéticas, foi constatada a presença de dois integrantes da nova família de proteínas REase, denominados de TaREaseI e TaREaseII, em T. absoluta. Esse é o primeiro relato da presença de mais de um membro dessa família de proteínas em uma espécie da ordem Lepidoptera. Entretanto, a análise de expressão relativa de TaREaseI e TaREaseII após a exposição a moléculas de dsRNA homólogas a regiões do gene codificador da proteína fluorescente GFP não demonstrou diferenças significativas de expressão.The tomato leafminer Tuta absoluta Meyrick (Lepidoptera: Gelechiidae), native to South America, is an important pest of the Solanaceae family and one of the most economically devastating pests of tomato (Solanum lycopersicum) in the world. This pest was identified in Brazil in the 1980s and invaded Europe in 2006, where it spread to important tomato-producing regions, causing great losses. The main control strategy is the use of chemical insecticides, but the indiscriminate use of these products has led to a loss of effectiveness and the resistance of T. absoluta has been reported. Therefore, the search for alternative approaches to control this insect pest is necessary and the use of the RNAi (interfering RNA) technique has been shown to be a great potential alternative for the control of T. absoluta. RNAi consists of a post-transcriptional regulation mechanism at the mRNA level, leading to gene silencing triggered by exposure to double-stranded RNA (dsRNA) molecules. However, it is known that the use of this technique varies between insect orders and species, and the Lepidoptera order has been identified as recalcitrant to gene silencing by RNAi. In this sense, nucleases present in the gut lumen of insects capable to degrade dsRNA have been identified as a plausible mechanism associated with the RNAi-recalcitrance of this order. Recently, the nuclease RNAi efficiency related nuclease (REase) has been described, that is present in the midgut of insects of the Lepidoptera order and which are capable of digesting dsRNA molecules before processing by the Dicer enzyme, affecting the efficiency of RNAi. Thus, this work aimed to search for ribonucleases in the T. absoluta transcriptome as the newly discovered REase and to investigate its relationship with the RNAi efficiency use of this technique in this insect pest. After searching for the sequences, five contigs were identified, and three presented the characteristic PIN domain., and after phylogenetic analyzes, the presence of two members of the new family of REase proteins, named as TaREaseI and TaREaseII, was identified in T. absoluta. This is the first report of the presence of more than one member of this protein family in a Lepidoptera order species. However, the relative expression analysis of TaREaseI and TaREaseII after exposure to dsRNA homologous to regions of the gene encoding the GFP fluorescent protein molecules did not demonstrate significant differences in expression