Mécanismes de régulation impliqués dans la résistance aux antibiotiques chez Mycobacterium abscessus

Mycobacterium abscessus is an environmental non-tuberculous mycobacteria causing severe lung infections in cystic fibrosis patients. Its intrinsic resistance to antibiotics renders treatments extremely challenging. This pathogen has developed a wide panel of strategies to resist to antibiotics, including efflux pumps and target-modifying enzymes. Standard antibiotherapy combines an aminoglycoside (amikacin (AMK)), -lactams (imipenem (IPM)) and macrolides (clarithromycin (CLR) or azithromycin (AZM)). My thesis was focusing on the regulation of antibiotic resistance mechanisms involving efflux pumps from the MmpL family as well as an enzyme modifying the macrolide target. Selection of resistant mutants against thiacetazone derivatives (TACd) and clofazimine (CFZ) unraveled mutations in the TetR regulators MAB_4384 and MAB_2299c, respectively. The CFZ-mutants, also co-resistant to bedaquiline (BDQ), overexpress two distinct MmpS/MmpL, MAB_135c/1134c and MAB_2300/2301 while the TACd mutants overproduce the MAB_4383c/4382c efflux pump. Biochemical, genetic and structural approaches confirmed their involvement in drug resistance mechanisms. MAB_2299c could therefore represent a potential resistance marker to monitor in strains isolated from patients under CFZ/BDQ therapy. The methyltransferase Erm(41) modifies the adenosine 2058 of the ribosomal 23S rRNA, protecting the ribosome from the macrolides. WhiB7 may represent a major actor in inducible resistance, observed in 40% of clinical cases, often leading to treatment failure. We confirmed the role of WhiB7 in this process and showed that inducible resistance occurred also in vivo in the zebrafish model. Our data suggest that AZM is a stronger and faster resistance inducer than CLR in vitro and that both drugs show antagonism with AMK, thus reducing drugs’ efficacy. This work enriched our knowledge regarding both MmpL-mediated and macrolides inducible resistance mechanism against M. abscessus. It also provides new efficient tools to investigate the function of proteins through a novel unmarked gene deletion approach and to rapidly assay new antibiotics to counteract inducible macrolide resistance.Mycobacterium abscessus est une bactérie environnementale non-tuberculeuse causant des infections pulmonaires sévères chez les patients atteints de mucoviscidose. Sa résistance intrinsèque aux antibiotiques rend les infections à M. abscessus extrêmement difficiles à traiter. Ses mécanismes de résistance sont variés et incluent des pompes à efflux expulsant les antibiotiques ainsi que des enzymes modifiant leurs cibles. La trithérapie standarde contre M. abscessus implique un aminoglycoside (amikacine (AMK)), une -lactamine (imipénème (IPM)) et un macrolide (clarithromycine (CLR) ou azithromycine (AZM). Ma thèse a porté sur la régulation de nouveaux mécanismes d’antibiorésistance via des pompes à efflux de la famille MmpL ainsi que sur une enzyme modifiant la cible des macrolides. La sélection de mutants résistants aux dérivés du thiacétazone (TACd) et à la clofazimine (CFZ) a permis d’identifier des mutations dans les régulateurs TetR MAB_4384 et MAB_2299c, respectivement. Les mutants CFZ, également co-résistants à la bédaquiline (BDQ), surexpriment deux MmpS/MmpL distincts, MAB_1135c/1134c et MAB_2300/2301 tandis que les mutants TACd surproduisent le système MmpS/MmpL MAB_4383c/4382c. Des approches biochimiques, génétiques et structurales ont confirmé le rôle de ces protéines dans la résistance à ces composés et ont permis de disséquer le mode de régulation. Ainsi, MAB_2299c représenterait un marqueur de résistance à exploiter chez des patients traités par CFZ ou BDQ. La méthyltransférase Erm(41) modifie l’adénosine 2058 de l’ARNr 23S du ribosome, bloquant l’action des macrolides. WhiB7 serait l’activateur de cette résistance inductible observée chez 40% des isolats cliniques, conduisant souvent à l’échec thérapeutique. Nous avons confirmé le rôle de WhiB7 dans ce mécanisme et montré que la résistance inductible opérait in vivo chez le modèle zebrafish. Nos résultats indiquent que l’AZM induit une résistance plus rapide et forte que la CLR in vitro et qu’elles exercent un effet antagoniste sur l’AMK, réduisant l’efficacité du traitement. Ces travaux décrivent l’export d’antibiotique via des MmpL et la résistance adaptative aux macrolides chez M. abscessus. Enfin, ils apportent des nouveaux outils génétiques performants pour étudier la fonction de protéines d’intérêt via une nouvelle technique de délétion génique et pour tester rapidement de nouveaux antibiotiques contournant la résistance induite aux macrolides