Mécanismes d'adressage et de rétention de la triadine à la triade au sein du muscle squelettique

Skeletal muscle is a complex tissue made up of many muscle cells. When a motor neuron in contact with muscle cells, emits an action potential, it propagates along the plasma membrane where it allows the activation of the calcium release complex (CRC), the massive calcium release of terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum (SR) in the cytosol, and thus muscle contraction. This mechanism, called excitation-contraction coupling, requires a specific site of contact between the plasma membrane and the RS, called the triad. More precisely, a triad is composed of an invagination of the plasma membrane, the T-tubule, flanked by two terminal cisternae of the SR. At the triads, the CRC is centered on two calcium channels, the Dihydropyridine Receptor (DHPR) and the Ryanodine Receptor (RyR1), very precisely located face to face in their respective membranes: the T-tubule membrane and the membrane of the SR. Thus, when the membrane is depolarized, the DHPR undergoes a conformational change allowing the opening of RyR1 channel and the release of the calcium. CRC also contains other triad-specific proteins such as calsequestrin or triadin, which have key roles in modulating calcium release. Initiation of contraction thus depends on the precise contact between the SR membranes and the T-tubule membranes and also the exclusive localization of the CRC proteins at the triads. Nevertheless, the mechanisms underlying the precise organization of CRC proteins to the triad remain unknown.During this work, we focused on triadin, a CRC protein that would anchor other CRC proteins through the different interactions it has with RyR1, with calsequestrin and also with microtubules. We studied the mechanisms of trafficking and retention of triadin during muscle differentiation. To do this, the dynamics of triadin was explored by microscopy techniques and by reintroducing, using lentivirus, fluorescent triadin chimeras into differentiated muscle cells.Firstly, the study of CRC proteins targeting and retention in the triad revealed that triadin would take a vesicular pathway to exit the reticulum and reach the triads. This vesicular trafficking pathway would use the microtubule cytoskeleton and in particular the molecular motors and could be a pathway specific to skeletal muscle. In a second step and in later stages of differentiation, triadin would diffuse into SR membranes followed by its accumulation at the triads. Both mechanisms, diffusion and vesicular trafficking, could, however, coexist in a muscle cell. In all cases, once the triad is reached, triadin would be retained thanks to its transmembrane domain. Moreover, I also had the opportunity to take part in a project on the involvement of the MAP6 protein in muscle function. This project has shown that MAP6 is present in skeletal muscle and that its absence leads to muscle weakness associated with a decrease in calcium releases, as well as an impairment of the microtubule network and the organization of SR.Le muscle squelettique est un tissu complexe constitué de nombreuses cellules musculaires. Lorsqu’un motoneurone en contact avec ces cellules, émet un potentiel d’action, celui-ci se propage le long de la membrane plasmique où il permet l’activation du complexe de relâchement du calcium (CRC), la sortie massive de calcium des citernes terminales du réticulum sarcoplasmique (RS) dans le cytosol, et ainsi la contraction musculaire. Ce mécanisme, appelé couplage excitation-contraction, requière un site de contact spécifique entre la membrane plasmique et le RS, appelé triade. Cette dernière est composée d’une invagination de la membrane plasmique, le tubule-t, flanquée de deux citernes terminales du RS. Au sein des triades, le CRC est centré autour de deux canaux calciques, le récepteur des Dihydropyridines (DHPR) et le récepteur de la Ryanodine (RyR1), très précisément localisés face à face dans leurs membranes respectives : la membrane du tubule-t et la membrane du RS. Ainsi, quand la membrane est dépolarisée, le DHPR subit un changement de conformation permettant l’ouverture du canal RyR1 et la sortie du calcium. Le CRC contient également d’autres protéines précisément localisées à la triade comme la calséquestrine ou la triadine, ayant des rôles clés pour moduler la libération du calcium. L’initiation de la contraction dépend ainsi du contact précis entre la membrane du RS et la membrane du tubule-t et également de la localisation exclusive des protéines du CRC au sein de la triade. Néanmoins, les mécanismes sous-jacents à l’organisation précise des protéines du CRC à la triade, restent inconnus.Durant cette thèse, nous nous sommes focalisés sur la triadine protéine du CRC qui servirait d’ancre aux autres protéines du CRC grâce à ses différentes interactions. Nous avons étudié les mécanismes de trafic et de rétention de la triadine au cours de la différenciation musculaire. Pour ce faire, la dynamique de la triadine a été explorée par des techniques de microscopie et en réintroduisant, grâce à des lentivirus, des chimères fluorescentes de triadine au sein de cellules musculaires différenciées.Dans un premier temps l’étude de l’adressage et de la rétention des protéines du CRC à la triade a révélé que la triadine emprunterait une voie vésiculaire pour sortir du reticulum et atteindre les triades. Cette voie de trafic vésiculaire utiliserait le cytosquelette de microtubules et notamment les moteurs moléculaires et pourrait être une voie spécifique au muscle squelettique. Dans un deuxième temps et dans des étapes plus tardives de la différenciation, la triadine diffuserait dans les membranes du RS suivie de son accumulation aux triades. Les deux mécanismes, diffusion et trafic vésiculaire, pourraient cependant coexister dans une cellule musculaire. Dans tous les cas, une fois la triade atteinte, la triadine y serait retenue grâce à son domaine transmembranaire. Durant ma thèse, j’ai également eu l’opportunité de prendre part à un projet portant sur l’implication de la protéine MAP6 dans la fonction musculaire. Ce projet a permis de montrer que MAP6 est bien présente dans le muscle squelettique et que son absence donne lieu à une faiblesse musculaire due en partie à une diminution des relâchements calciques, ainsi qu’à une altération du réseau de microtubules et de l’organisation du RS