Application in situ de la spectroscopie proche infrarouge (NIRS) pour la surveillance de la production de biopharmaceutiques par cultures cellulaires

The complexity of biopharmaceutical products implies that their approval is based on a specific process. Any further change, especially in the process, requires drug validation in terms of clinical effects and biosecurity. Because changes in the processes may be unavoidable, quality assurance by inspection at the end of the process (Quality by Testing-QbT) tends to be replaced by a new quality perspective called Quality by design (QbD) which builds drug Critical Quality Attributes (CQA) controlling key Critical Process Parameters (CPP) in real-time. However, QbD implementation has been limited by the complexity of cell culture processes and the need for multivariate methods that allow the use of complex signals from process analyzers as monitoring instruments. Consequently, the objective of this work has been to develop new methodological and experimental applications, based on in situ NIR spectroscopy, for real-time monitoring of biopharmaceutical-producing cell cultures using two production platforms: animal cells (CHO-250-9) producing monoclonal antibodies (mAb) and plant cells (Cantharanthus roseus) producing antineoplastic molecules (vincristine-VC and vinblastine-VB). First, a process capable of producing VC and VB was generated, cell differentiation was identified as CPP and the ability to monitor it by in situ NIR spectroscopy was firstly demonstrated using calibration models based on partial least squares regression (PLSR). Subsequently in CHO cell cultures, different regression techniques were evaluated to generate calibration models to monitor CPP and CQA. PLSR was inadequate because of the chemical and physical variability that CHO cell cultures present during the different phases of batch culture. Local Weighted Regression (LWR) was adequate to monitor classic CPP (concentration of glucose, lactate, and viable cells, amongst others) since it adequately handled the variability associated with the progression of cell culture. However, for the glycosylation profile (CQA), it was unable to properly handle the complex nonlinear relationships between NIR spectra and the concentration of various monoclonal antibody (mAb) glycoforms. This was overcome with the use of models based on support vector regressions (SVR), allowing the generation of models of different mAb glycoforms related to particular clinical effects. Globally, this work has contributed to the expansion of the capabilities of in situ NIR spectroscopy for the monitoring of classic CPP in a more precise way, new innovative CPP such as cell physiological state in plant suspension cultures, and CQA such as mAb glycosylation profiles linked to clinical characteristics in animal cell cultures.La complexité des médicaments biopharmaceutiques implique que leur validation par les instances réglementaires nécessite un processus spécifique. Tout changement, notamment du procédé, nécessite une nouvelle validation en termes d’efficacité clinique et de sécurité pour le patient. Puisque les changements dans le procédé sont parfois inévitables, la qualité du produit n’a plus à être évaluée uniquement en fin de procédé de production (Quality by testing, QbT), mais tout au long du procédé, et conceptualisée dans toutes les étapes de fabrication (Quality by Design, QbD). Cette démarche préconise de contrôler les paramètres critiques du procédé (CPP) en temps réel afin de maintenir les attributs de qualité critiques (CQA) dans une zone de confiance préalablement définie. Cependant, la mise en œuvre du QbD est actuellement limitée dans l’industrie biopharmaceutique en raison de la complexité des procédés de culture cellulaire ainsi que par la nécessité d’utiliser des méthodes d’analyse multivariée de données issues des analyseurs du procédé (i.e. méthodes spectroscopiques). L’objectif de ce travail a dont été de développer de nouvelles applications méthodologiques et expérimentales, basées sur la spectroscopie proche infrarouge (NIR) in situ, pour le suivi en temps réel de cultures de cellules produisant des biopharmaceutiques. Pour cela, deux modèles cellulaires ont été étudiés : des cellules de hamster chinois (CHO) produisant un anticorps monoclonal (mAb) et des cellules de plantes (Cantharanthus roseus) produisant des molécules anticancéreuses (la vincristine, VC et la vinblastine, VB). Dans un premier temps, un procédé permettant la production de VC et de VB a été développé. La différentiation cellulaire de Catharanthus roseus ayant été identifiée comme un CPP, son suivi en ligne a été rendu possible grâce à l’utilisation combinée de la spectroscopie NIR et de modèles de calibration basés sur la régression des moindres carrés partiels (PLS). Dans un second temps, pour les cultures de cellules CHO, différentes techniques de régressions ont été évaluées pour générer des modèles de calibration permettant le suivi en ligne des CPP et des CQA. La régression PLS s’est révélée inadéquate en raison de la variabilité chimique et physique que les cellules CHO entrainent durant les différentes phases de culture. Au contraire, la régression LWR (Local Weighted Regression) a permis de suivre en temps réel des CPP conventionnels (concentration en glucose, en lactate, en cellules vivantes,…). Cette régression permet de gérer de manière adéquate la variabilité associée à la culture cellulaire. Cependant, pour le suivi du profil de glycosylation des anticorps (CQA), cette régression n’est pas capable de gérer les relations non-linéaires existantes entre les spectres NIR et les concentrations en diverses formes d’anticorps glycosylés. Ce suivi en ligne des différentes glycoformes a été rendu possible uniquement par l’utilisation de la régression SVR (Support Vector Regressions). Ainsi, ce travail a permis l’amélioration du suivi en ligne de CPP par la spectroscopie NIR, mais également le suivi de nouveaux CPP comme l’état physiologique de cellules de plantes ou encore les différentes glycoformes des anticorps