Caractérisation de facteurs de virulence impliquant les systèmes de sécrétion bactériens

Pseudomonas aeruginosa is the causative agent of nosocomial infections. Those infections are a real threat to public health, considering that P. aeruginosa is a member of the ESKAPE pathogens family. Those pathogens developed numerous antibiotic resistance mechanisms that allow them to escape the lethality of common treatments. More than just resistant, P. aeruginosa is able to make use of several virulence factors, and among them, the type V secretion system, which is the main subject of my PhD.A new virulent P. aeruginosa strain was discovered in Grenoble University Hospital several years ago. This strain lacked the virulence factors of common studied cytotoxic strains but, still displayed high toxicity. This was related to the expression of two proteins, ExlB and ExlA, that are part of the T5SSb and display a complete new mechanism of action (no protein homologs are found). The ExlA toxin is able to form pores in the eukaryotic cell membrane leading to their death. The aim of my PhD was to understand on a molecular level the mechanism of ExlA toxicity.To decipher the activity of this toxin, we divided it in two domains, studied separately. Using NMR, SEC-MALLS, liposome floating assay, SAXS and AFM techniques, we were able to prove that the C-terminal domain of ExlA was a « molten globule » in solution and was able to form holes in reconstituted lipid bilayers. This domain seems to be the key to lipid interaction by the whole protein. Additional in vivo studies of the N-terminal domain and on full-length ExlA allowed us to propose a putative model of the mechanism of this novel toxin.Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable de sévères infections nosocomiales. Ces infections sont un réel problème pour la santé publique car P. aeruginosa fait partie des pathogènes ESKAPE qui ont développé des facteurs de résistance aux antibiotiques ce qui leur permet d’échapper aux traitements classiques. P. aeruginosa, en plus d’être résistante aux antibiotiques est capable d’exprimer de nombreux facteurs de virulences. Parmi ces facteurs on retrouve les systèmes de sécrétion de type V (SST5) sur lequel j’ai pu travailler durant ma thèse.Une nouvelle souche de P. aeruginosa a été découverte à Grenoble il y a quelques années. Cette souche n’exprime pas les mêmes facteurs de virulence que les souches communément étudiées mais en demeure bien plus toxique. La toxicité de cette souche est due à l’expression de deux protéines ExlB et ExlA faisant partie de la famille du SST5b et ayant un mécanisme d’action complètement nouveau car aucun homologue n’est connu. La toxine ExlA est capable de faire des pores dans les membranes des cellules eucaryotes entrainant leur mort. Le but de ma thèse était donc de comprendre à l’échelle moléculaire le fonctionnement de ExlA.Pour identifier le mécanisme d’action de cette toxine, nous l’avons divisée en deux domaines que nous avons étudiés séparément. En utilisant des techniques de RMN, de SEC-MALLS, de flottaison différentielle, de SAXS et d’AFM, nous avons pu définir que le domaine C-terminal de cette protéine était un « molten globule» en solution et était capable de faire des trous dans les membranes lipidiques reconstituées. Ce domaine semble être le domaine responsable de l’interaction d’ExlA avec les lipides. Ceci additionné à des études menées in vivo sur la toxine ExlA complète et comportant uniquement son domaine N-terminal nous a permis de définir un possible mécanisme d’action de la toxine ExlA. La somme de nos études fait l’objet d’un article en cours d’écriture