Production et caractérisation d'un substitut dermique humain pour étudier la réponse de la matrice extracellulaire dans les phénomènes d'électroporation

Electroporation is a physical technique using external electric field application to efficiently deliver therapeutic molecules of interest in targeted tissues. Its principle is based on a transient permeabilization of the plasma membrane, which facilitates the entry of molecules inside the cell. The main clinical application is electrochemotherapy (ECT), a local cancer treatment already used for treatment of primary tumors and metastases. The second medical application of electroporation is gene electrotransfer (GET), which is a method to introduce plasmids inside cells. Electroporation is also a method used to kill cells, through permanent plasma membrane permeabilization, called irreversible electroporation (IRE). Even if the in vitro mechanisms are more and more understood, in vivo effectiveness remains partial, depending on the targeted tissue type. Indeed, although DNA electrotransfer is highly effective for gene delivery on 2D cell culture in vitro, it is often much less efficient in vivo, which leads to a limited use for clinical applications. In vivo tissue organization is more complex than cell culture in vitro since cells develop intercellular junctions and produce extracellular matrix (ECM). The ECM composition was shown in vivo to modulate gene electrotransfer efficiency, so it seems to play a role in the mechanisms governing the biodistribution of DNA in a complex environment. Very little is known about ECM role and response to electric field application in this process. A better understanding of the effects of the electric field on the ECM would improve the efficiency of this method. Classical 2D models used for the study of electroporation do not exhibit this three-dimensional (3D) architectural organization allowing them to be physiologically comparable to native tissue. In order to study DNA electrotransfer mechanisms at tissue scale, we integrate the use of human 3D skin model that helps to mimic and predict in vivo situation. The objectives of this work were to investigate the role and response of cutaneous ECM during gene electrotransfer at tissue scale. The first part of this project was to characterize the ECM content of a 3D reconstructed human dermal substitute produced by tissue engineering. ECM was characterized in this tissue by electron microscopy, histology staining and generation of second harmonic (SHG). To assess if this model can efficiently mimic the in vivo response observed during electroporation, a range voltage using ECT or GET electrical parameters were apply and cell permeabilization as well as plasmid expression were analyzed on fresh tissue by two-photon microscopy. In the second part, we studied direct and indirect effects of pulsed electric field on the fibrillary collagens.[...]L'électroporation est une méthode physique utilisant le champ électrique pour perméabiliser transitoirement la membrane plasmique afin de faciliter l'entrée de molécules d'intérêt thérapeutique dans les tissus ciblés. La principale application clinique est l'électrochimiothérapie (ECT), un traitement anticancéreux local utilisé pour traiter les tumeurs primaires et métastases. La seconde application est l'électrotransfert de gène (EGT), une méthode pour introduire des acides nucléiques à l'intérieur des cellules. Enfin, l'électroporation irréversible (IRE) est une méthode utilisée pour tuer les cellules grâce à la perméabilisation permanente des membranes plasmiques. Même si les mécanismes in vitro sont de mieux en mieux compris, l'efficacité in vivo est variable selon le tissu cible. En effet, bien que l'électrotransfert d'ADN soit très efficace in vitro sur des cultures en deux dimensions (2D), il est souvent beaucoup moins efficace in vivo, ce qui limite ses applications cliniques. L'organisation du tissu in vivo est plus complexe que la culture cellulaire in vitro car les cellules développent des jonctions intercellulaires et une matrice extracellulaire (MEC). Des études in vivo ont démontré que la composition de la MEC module la biodistribution de l'ADN dans le tissu et donc l'efficacité de l'électrotransfert de gène. La réponse de la MEC à l'application de champ électrique dans ce processus reste encore à définir afin d'améliorer l'efficacité de cette méthode. Les modèles classiques en 2D ne possèdent pas cette organisation architecturale tridimensionnelle (3D) leur permettant d'être physiologiquement comparable au tissu natif. Afin d'étudier les mécanismes d'électrotransfert d'ADN à l'échelle des tissus, nous avons utilisé un modèle de peau humaine 3D pour imiter et prédire les situations in vivo. Les objectifs de ce travail étaient d'étudier le rôle et la réponse de la MEC cutanée lors de l'électrotransfert de gène à l'échelle du tissu. La première partie de ce projet a été de caractériser la MEC du substitut dermique reconstruit par ingénierie tissulaire. La MEC a été caractérisée par microscopie électronique, coloration histologique et génération de seconde harmonique (SHG). Pour évaluer si ce modèle imite efficacement la réponse in vivo observée lors de l'électroporation, une gamme de voltage utilisant des paramètres électriques ECT ou EGT a été appliquée et la perméabilisation cellulaire ainsi que l'expression du plasmide ont été analysées sur tissu frais. Dans la deuxième partie, nous avons étudié les effets directs et indirects du champ électrique pulsé sur les collagènes fibrillaires.[...