Análise das alterações dos genes CDH1 e VIM e sua associação com a transição epitelial mesenquimal (TEM) em carcinomas primários de mama e linfonodos axilares metastáticos

Orientadora: Profª Drª Enilze M. S. F. RibeiroCoorientador: Prof. Dr. Iglenir João CavalliTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 23/10/2017Inclui referências: p. 84-100Resumo: O câncer de mama é a neoplasia mais frequente em mulheres e apresenta o maior índice de mortalidade. A transição epitelial-mesenquimal (TEM) contribui para o processo metastático visto que é um evento onde células epiteliais neoplásicas ganham características mesenquimais. Para isso, uma série de mudanças podem ocorrer como alterações na expressão e no número de cópias dos genes. O gene VIM codifica a vimentina, uma proteína estrutural do citoesqueleto que contribui para a manutenção celular, garantindo a integridade citoplasmática, dando forma à célula e suporte às organelas. Quando a célula adquire a capacidade de deslocamento, a expressão de VIM se encontra alterada assim como a de CDH1. Este gene codifica a E-caderina, proteína que atua na adesão de células epiteliais apresentando baixa expressão quando relacionada com presença de metástase, diminuição da diferenciação do tumor e pior sobrevida. A análise da expressão destes genes e de dois mecanismos de regulação dos mesmos (número de cópias e status de metilação dos promotores) contribuirá para o entendimento da TEM em carcinomas primários de mama. As amostras (total de 137 tumores, 15 não tumorais e 28 linfonodos) foram cedidas pelo Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba, PR. As análises das expressões gênicas de CDH1 e VIM indicaram que nas amostras do sítio primário predominava o fenótipo epitelial. Posteriormente, foi observada a inversão das respectivas expressões com a progressão da doença, quando se analisou a expressão em linfonodo axilar metastático (2,85 para 0,30; 0,81 para 1,74, respectivamente para CDH1 e VIM). Foram analisados dois mecanismos que poderiam interferir na expressão gênica: o número de cópias gênicas e a metilação da região promotora. Para avaliar a variação do número de cópias foi utilizado PCR em tempo real, através da comparação com controle endógeno conhecido. Na análise de metilação da região promotora dos genes alvos foi utilizado o método de MSRE-PCR. Para o gene CDH1 verificou-se que a variação do número de cópias e a metilação parecem ter maior influência na regulação da expressão do que para o gene VIM. Em relação aos parâmetros clínicos e histopatológicos, verificou-se que a expressão dos genes e a alteração de seus números de cópias não são bons marcadores para distinguir subgrupos, porém o padrão de expressão é um forte indicador de progressão da doença. Palavras-chave: Câncer, transição, CDH1, VIM, TEM, gene, PCRAbstract: Breast cancer is the most frequent type of cancer in women and has the highest mortality rate. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) contributes to the metastatic process since it is an event where neoplastic epithelial cells gain mesenchymal characteristics. For this, a number of changes may occur like changes in expression and in number of copies of genes. The VIM gene encodes vimentin, a structural protein of the cytoskeleton that contributes to cell maintenance by ensuring cytoplasmic integrity, giving cell shape and organelle support. When the cell acquires displacement capacity, the expression of VIM is altered, as well as CDH1 expression. This gene encodes E-cadherin, a protein that acts on the adhesion of epithelial cells, presenting low expression when related to the presence of metastasis, decreased tumor differentiation and worst survival. The analysis of gene expression, copy number and promoter methylation status of these genes will contribute to the understanding of EMT in primary breast carcinomas. The samples were provided by Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba, PR. DNA extraction was performed using the Phenol-Chloroform method. Analysis of the CDH1 and VIM gene expression indicated that the epithelial phenotype predominated at the primary site samples. Subsequently, inversion of the respective expressions with disease progression was observed when the expression of metastatic axillary lymph node was analyzed (2.85 to 0.30, 0.81 to 1.74, respectively for CDH1 and VIM). Two mechanisms that could interfere with gene expression, number of gene copies and methylation of the promoter region, were analyzed. For the CDH1 gene it was found that the copy number variation and methylation appear to have a greater influence on the regulation of expression than for the VIM gene. Regarding the clinical and histopathological parameters, it was verified that the expression of genes and the alteration of their copy numbers are not good markers to distinguish subgroups, but the expression pattern is a strong indicator of disease progression. Keywords: Cancer, transition, CDH1, VIM, TEM, gene, PC