Regulation of meningeal IL-17+ immune cell homeostasis: (patho)physiological implications

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020The crosstalk between the Central Nervous System (CNS) and the immune system prompted the Neu-roimmunology field towards the relevance of immune cells in supporting steady-state brain physiology. The recent (re)discovery of meningeal lymphatic vessels containing a wide repertoire of immune cells in the steady state that drain into the cervical lymph nodes established meninges as a strategic anatomical site for the neuroimmune interface. A pioneer publication from the host laboratory revealed an unexpected role for meningeal IL-17 in the regulation of short-term working memory and revealed a novel foetal thymic-derived population of me-ningeal γδ T cell as the major source of IL-17 in the steady state CNS. Further studies highlighted the role of this cytokine in pathogen-avoidance behaviours and sociability. Notwithstanding, an IL-17 contribution to neuroinflammation is emphasized by its role during the de-velopment and progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and brain ischemia upon injury. Furthermore, unpublished results from the host laboratory revel that exacerbated levels of meningeal IL-17 seemingly promote the onset of Alzheimer’s Disease (AD). IL-17-dependent acceler-ated neurodegeneration was also reported in a Parkinson’s disease (PD) mice model. This suggests a dual role for IL-17 – pro-cognitive at steady state and anti-cognitive in the context of neurodegeneration – and implies a hypothetic meningeal IL-17 threshold, below which cognitive deficits would appear and above which pathogenic neuroinflammation would be triggered. Therefore, a fine-tuned regulation of meningeal IL-17 homeostasis is seemingly required to maintain brain integrity and cognitive functions. Built on this background, this project aims to decipher the cellular and molecular mechanisms that control such an important - yet unexplored - process. Based on the literature and RNA-sequencing data from the host laboratory, we postulated a potential contribution of stress, circadian clock and sleep to meningeal IL-17 immune cell homeostasis in pathophysiological conditions. To test this hypothesis, we resorted to flow cytometry techniques to analyse the survival, proliferation and cytokine response of purified γδ T cells stimulated in vitro with different concentrations of gluco-corticoids and in vivo glucocorticoid modulatory functions. Meningeal lymphocytes were also isolated from wild-type (WT) mice and from the 3xTg-AD mice model of AD for the characterization of IL-17 diurnal oscillatory pattern. Finally, the effect of sleep on meningeal IL-17 was tested by anesthetizing mice through intraperitoneal injections of ketamine/xylazine (K/X). We observed an increased percent-age, survival and proliferation of γδ T cells IL-17 producers (γδ17), the major contributor to IL-17 pro-duction in the meninges, to glucocorticoid stimulation in vitro in a dose-dependent manner. However, no effect was observed in meningeal IL-17-producing cells after in vivo injection of glucocorticoids. Additionally, a diurnal oscillation of the percentage of meningeal IL-17-producing cells, with a mini-mum during the light phase (bathyphase) and a peak during the dark phase (acrophase) was observed in WT mice. Conversely, the AD mice model and their littermate controls displayed no such oscillatory pattern. Our data also point at a reduction in meningeal IL-17-producing cells upon sleep. Although a stress contribution was not observed in vivo, our results suggest that circadian rhythms and sleep can regulate the homeostasis of IL-17-producing immune cells in the meninges. Importantly, both circadian clock and sleep are integrated systems that contribute to higher mental processes and neuro-degenerative disorders. Taken together, this exploratory study is a further step towards the characterization of meningeal immune subset biology. The modulation of these cues might give further insight into the cellular and molecular mechanisms that underlie learning and memory with a biomedical potential for neurodegenerative diseases.Recentemente o campo da Neuroimunologia alargou o seu clássico foco patológico e entrou numa era focada nas implicações desta interação num contexto não inflamatório. A interação entre o sistema ner-voso e o sistema imune durante o desenvolvimento, a vida adulta e o envelhecimento são importantes marcos a explorar que nos darão um vislumbre de questões desafiantes. A (re)descoberta dos vasos linfáticos meníngeos levou a uma reavaliação do conceito de cérebro como órgão imunologicamente privilegiado. Estudos recentes revelam que estes vasos linfáticos possuem um amplo repertório de células imunológicas qualificadas para monitorizar e proteger o sistema nervoso central (SNC) e influenciar as funções cerebrais através de moléculas solúveis, sem que ocorra infiltra-ção no parênquima cerebral. Diferentes citocinas produzidas por células imunes a partir dos espaços meníngeos demonstraram um efeito surpreendente na modulação das funções cerebrais. Particularmente, a produção de IL-4 por cé-lulas T CD4+ após a realização de tarefas cognitivas foi determinante na regulação da aprendizagem e memória a longo prazo. Uma recente publicação do laboratório de acolhimento demonstrou que a pro-dução de IL-17 nas meninges, uma citocina frequentemente implicada em contextos inflamatórios, tem um papel surpreendente na regulação da memória de trabalho espacial de curto prazo através da modu-lação da plasticidade sináptica no hipocampo. Esta publicação revelou ainda que uma nova população derivada do timo fetal – células T γδ – são a principal fonte de IL-17 no SNC saudável. Estes dados sugerem uma possível regulação diferencial de circuitos neuronais pelas diferentes citocinas presentes nos espaços meníngeos. A estas funções mediadas por IL-17 acrescem ainda as suas proprie-dades neuromoduladoras envolvidas em comportamentos de evasão a patógenos e na promoção da so-ciabilidade. Esta citocina emerge assim como novo ator em neurofisiologia. Apesar deste importante papel fisiológico, níveis exacerbados de IL-17 no SCN estão associados a morte neuronal e anomalias comportamentais. Para além disto, num contexto neuroinflamatório, a produção desta citocina por células T γδ tem um papel crucial no desenvolvimento de encefalomielite autoimune experimental (EAE) e na progressão de isquemia cerebral e défices neurológicos num modelo de lesão de isquemia-reperfusão (I/R) cerebral. Em ambos os modelos, as células T γδ produtoras de IL-17 (γδ17) presentes nas meninges desencadeiam um ciclo de amplificação imunológica local que irá alterar o mi-croambiente estromal do cérebro inflamado e causar ruturas na barreira hematoencefálica que contribui-rão para a progressão da doença. Resultados do laboratório de acolhimento demonstram ainda que num contexto neurodegenerativo, a produção exacerbada de IL-17 por células T γδ nas meninges está associada ao desencadeamento dos défices cognitivos observados num modelo de ratinho da doença de Alzheimer (3xTg-AD). A neutrali-zação desta citocina foi suficiente para prevenir os défices da memória de trabalho espacial de curto prazo e disfunção da plasticidade sináptica observados nas fases iniciais da doença. Concentrações ele-vadas de IL-17 no SCN estão ainda associadas à promoção da neurodegeneração num modelo de ratinho da doença de Parkinson. Estes dados sugerem um duplo papel da IL-17 no SCN. Enquanto a produção desta citocina em condi-ções fisiológicas é indispensável para as funções cognitivas, a sua produção exacerbada contribui para a propagação da neuroinflamação e neurodegeneração. Isto implica um limiar hipotético ideal da con-centração de IL-17 nas meninges, abaixo do qual surgiriam défices cognitivos e acima do qual se veri-ficaria um desencadeamento de processos neuroinflamatórios. Assim, o controlo rigoroso da concentra-ção desta citocina nas meninges parece indispensável para manter a integridade cerebral e as funções cognitivas. Com essa ideia em mente, este estudo exploratório tem como objetivo desvendar possíveis mecanismos homeostáticos que, em condições fisiológicas, regulariam diferentes produtores imunes de IL-17 presentes nos espaços meníngeos de forma a otimizar os níveis de IL-17. A desregulação de tais mecanismos poderá potencialmente contribuir para a acumulação desta citocina observada nas doenças neuroinflamatórias. Stress, ritmos circadianos e sono são processos com importantes implicações na modulação das respos-tas imunes e cerebrais em contextos patofisiológicos. Considerando os dados da literatura, recorremos à análise de dados obtidos em ensaios de sequenciação de RNA realizados em diferentes populações de linfócitos T γδ isolados a partir de nódulos linfáticos periféricos. Estes dados permitiram observar que células T γδ produtoras de IL-17 (γδ17) sobreexpressam recetores de catecolaminas e glucocorticoides, assim como genes que codificam os principais reguladores dos ritmos circadianos, comparativamente com as populações de células T γδ produtoras de IFN-γ ou duplas negativas. Para testar uma potencial contribuição do stress na modulação das propriedades efetoras das células T γδ17, células T γδ totais ou as suas diferentes populações foram isoladas e colocadas em cultura com diferentes concentrações de glucocorticoides. Esta estimulação resultou num aumento da percentagem de células T γδ17 de forma proporcional à concentração, mediada pela estimulação da sua sobrevivência e proliferação. Estes dados corroboraram os resultados obtidos por sequenciação de RNA, ao sugerir que células T γδ17 são preferencialmente afetadas por glucocorticoides comparativamente com as res-tantes populações. Para analisar uma possível contribuição do stress na modulação de células meníngeas produtoras de IL-17 recorremos à injeção intraperitoneal de glucocorticoides in vivo. Surpreendentemente, não foi obser-vado nenhum efeito significativo nos espaços meníngeos quatro horas após a injeção, embora uma mo-dulação de células produtoras de IL-17 tenha sido observada em órgãos linfoides periféricos, corrobo-rando os resultados obtidos in vitro. Para avaliar um possível envolvimento dos ritmos circadianos, células meníngeas foram isoladas de ratinhos em diferentes fases do dia para avaliar a produção de IL-17. Observou-se uma oscilação diurna da percentagem de células meníngeas produtoras de IL-17 que atingiu o seu valor mais baixo a meio do dia (batifase) e o seu valor mais alto durante a noite (acrofase). Estes dados indicam um potencial efeito dos ritmos circadianos na produção de IL-17 nas meninges. Considerando que as doenças neurodegenerativas estão geralmente associadas a distúrbios circadianos e a acumulação de IL-17 nas meninges está associada ao início dos défices cognitivos observados num modelo de ratinho da doença de Alzheimer, em seguida postulámos que estes distúrbios poderiam con-tribuir para a acumulação de IL-17 verificada neste modelo que se traduziriam numa desregulação da oscilação diurna das células produtoras de IL-17 previamente observada. Inesperadamente nem os rati-nhos controlo nem os ratinhos 3xTg-AD utilizados demonstraram uma oscilação diurna nestas células. Estes dados indicam que outras variantes como o contexto genético, idade ou sexo possam ter influen-ciado os resultados obtidos. Considerando a interação entre os ritmos circadianos e o sono, em seguida postulámos que este último poderia regular a homeostase das células imunes produtoras de IL-17 das meninges. Para testar esta hipótese foi injetada uma solução anestésica de cetamina/xilazina que reproduz as principais caracterís-ticas do sono e as células meníngeas foram isoladas uma hora e meia depois. Esta técnica permitiu-nos observar uma redução nas células produtoras de IL-17 nas meninges, sugerindo que o sono poderá ser outro mecanismo de regulação destas células em contextos fisiológicos. No seu conjunto, embora uma contribuição do stress não tenha sido observada in vivo, os nossos resul-tados sugerem que os ritmos circadianos e o sono podem regular a homeostase das células imunes pro-dutoras de IL-17 nas meninges. É importante destacar que estes dois processos estão fortemente interli-gados e ambos contribuem para processos mentais superiores e distúrbios neurodegenerativos. Este estudo exploratório é assim mais um passo para a caracterização da biológica das células imunes meníngeas e, se validados, estes resultados poderão ter grandes implicações na manipulação da produção de IL-17 nas meninges. A modulação destes processos homeostáticos poderá contribuir para aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos celulares e moleculares que fundamentam a aprendizagem e a memória com um potencial biomédico para doenças neurodegenerativas