The Research of the Activity of Multidrug Resistance Efflux Pumps in Salmonella enterica

Šiame darbe buvo ištirti tetrafenilfosfonio ir etidžio katijonų sąveikos su S. enterica ser.Typhimurium ląstelėmis ypatumai bei nustatytas slopiklių derinių poveikis daugiavaisčio atsparumo (DVA) siurblių veiklai. Tyrimai atlikti vykdant potenciometrinius ir spektrofluorimetrinius matavimus. Daugiavaisčio atsparumo siurbliai yra aktyvūs nešikliai, šalinantys iš ląstelės antibiotikus ir kitas joms nuodingas medžiagas. Tyrimuose naudotas efektyviausias RND šeimos siurblių slopiklis – fenilalanilarginil-β-naftilamidas (PAβN), tačiau jo vieno nepakanka visų DVA siurblių nuslopinimui. Be to, kol kas nėra išaiškintas tikslus jo veikimo mechanizmas. Dėl šios priežasties buvo panaudoti ir kiti slopikliai, tokie kaip chlorpromazinas (CPZ), 1-(1-naftilmetil)piperazinas (NMP) bei rezerpinas (Rez). Dėl kontraversiškų teiginių apie Ca2+ jonų įtaką siurblių efektyvumui didinti, buvo aiškinamasis jų poveikis DVA siurbliams S. entericabakterijose. Atlikus tyrimus nustatyta, kad antibiotikas polimiksinas B išstumia etidį iš jo surišimo vietų ląstelėse. Į ląstelių inkubavimo terpę įdėti Ca2+ jonai atstato EDTA pagalba pralaidintos išorinės membranos barjerinę funkciją, tačiau neaktyvina DVA siurblių. Gliukozė nesukelia Et+, PAβN+ ir NMP+ jonų išmetimo iš S. enterica ląstelių, nes jie nėra tokie pat DVA siurblių substratai kaip tetrafenilfosfonio jonai. DVA siurblių slopiklis PAβN konkuruoja su chlorpromazinu, bet NMP ir rezerpinas jo veikimui įtakos neturi. NMP turi du veikimo taikinius, o vienas jų yra bendras su CPZ: CPZ neveikia jei dedamas po NMP, o NMP po CPZ priedo papildomai slopina DVA siurblius. Rezerpinas ir NMP konkuruoja tarpusavyje dėl sąveikos su TPP+ išmetančiais siurbliais, o CPZ ir Rez netrukdo vienas kito veikimui, nes turi S. enterica ląstelėse skirtingus taikinius.The aim of this studywas to assaythe accumulation of tetraphenylphosphonium (TPP+) and Etidium (Et+) cationsin S. entericaser. Typhimurium cells and to determine effects of inhibitors on the activity of multidrug resistance pumps in these cells. Potentiometric and spectrofluorimetric methodswere used in thisstudy. Multidrug resistance efflux pumps are active transporters, responsible for the extrusion of toxic substances and antibiotic out of the cells. The most effective inhibitor of RND efflux pumps Phe-Arg-β-naphthylamide (PAN) was used in this study but it alone cannot completely suppress the activity of efflux pumps. Moreover, the exact mechanism of PAN action is still not clarified. For this reason we used in our experiments also other efflux inhibitors, such as chlorpromazine (CPZ), 1-(1-naphthylmethyl)piperazine (NMP) and reserpine (Res). Because of the controversial statements about the influence of Ca2+ ions on the efficiency of MDR pumps we studied also the effects of Ca2+ ions on the efflux of indicator cations from S. enterica cells. Monitoring of concentration of indicatory ions in the medium revealed that antibiotic polymyxin B can displace Et+ from its binding sites on cells. Ca2+ ions restore the barrier properties of EDTA-permeabilized outer membrane but it does not activate MDR pumps. Glucose does not cause the extrusion of Et+, PAβN+ and NMP+ ions, because they are not the same substrates of MDR pumps as TPP+ ions. Interaction between PAβN and CPZ is concurrent but reserpine and NMP do not affect the activity of PAβN. NMP has two operating targets and one of them is common with CPZ. Therefore, CPZ does not work after NMP, furthermore, NMP is active after CPZ supplement. Reserpine and NMP both compete for the interaction with the ion-binding pumpsof TPP+. CPZ and reserpine have two different targets in S. enetrica cells.Gamtos mokslų fakultetasVytauto Didžiojo universiteta