The effect of hyperthermia, acetaminophen (APP) and its metabolite N-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI) on the amount of oxidized and reduced glutathione (GSSG and GSH) in isolated mitochondria and hepatoma cells

Hipertermija vadinamas kūno temperatūros padidėjimas virš normalių ribų, esant nesutrikusiai termoreguliacijai. Hipertermija veikdama kartu su vaistais, tarp jų ir antipiretiku APP, gali turėti įvairų poveikį hepatomos ląstelėms ir jų mitochondrijų funkcijoms.Acetaminofenas (APP, APAP arba paracetamolis) N-(4-hidroksifenil)-acetamidas yra plačiai naudojamas analgetikas-antipiretikas, kurio perdozavimas sukelia kepenų pažeidimus, taip pat kaip ir jo toksiškas metabolitas N-acetil-p-benzochinono iminas (NAPQI), kuris detoksikuojamas reaguojant su GSH . Glutationas yra universalus tripeptidas, ɣ-glutamilcisteino glicinas, aptinkamas daugelyje augalų, mikroorganizmų ir visų žinduolių audiniuose. Glutationas egzistuoja redukuotoje formoje (GSH) ir disulfido oksiduotoje formoje (GSSG). Esan didelėms dozėms APP, yra išsekinamas ląstelės GSH, todėl NAPQI pradeda kovalentiškai jungtis su ląstelės baltymais tarp jų ir mitochondrijų baltymais,tai sukelia mitochondrijų disfunkcijasar net ląstelės žūtį. Todėl šiame darbe įvertinome hipertermijos ir acetamino (APP) bei jo metabolito N-acetil-p-benzochinono imino (NAPQI) poveikį oksiduoto ir redukuoto glutationo (GSH ir GSSG) kiekiui izoliuotose kepenų mitochondrijose ir hepatomos ląstelėse. Nustatėme APP ir NAPQI poveikį oksiduoto ir redukuoto glutationo (GSH ir GSSG) kiekiui kepenų mitochondrijose, esant skirtingoms temperatūroms (37, 42 ir 45 oC) ir gavo, kad APP ir hipertermija mažina bendrą, GSH ir GSSG glutationo kiekį. Didžiausias mažėjimas pastebimas, esant 42°C hipertermijai. Darbe taip pat buvo nustatyta APP ir NAPQI poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui III-oje metabolinėje būsenoje, esant skirtingoms temperatūroms (37, 39 40, 42 ir 45oC), naudojant skirtingus substratus (P+M ir G+M). Šio eksperimento rezultatai parodė, kad APP poveikis V3, naudojant G+M buvo didesnis, nei piruvato oksidacijos atveju visose tirtose temperatūrose. Tokie tyrimų rezultatai rodo, kad glutamato oksidacijos fermentinė sistema yra jautresnė APP poveikiui. Atlikti tyrimus su NAPQI yra problematiška. Tačiau pastebėta, kad naudojant P+M žymiai slopino V3 ir poveikis šiek tiek mažėjo didinant inkubavimo temperatūrą. Taip pat nustatėme APP poveikį hepatomos ląstelių gyvybingumui ir proliferacijai, esant karščiavimui būdingojai (38°C) temperatūrai. Rezultatai parodė, kad APP mažina ląstelių gyvybingumą karščiuojant, tačiau APP poveikis hepatomos ląstelių proliferacijai yra mažesnis, nei jo nevartojimas, esant karščiavimo temperatūrai. Šiame darbe taip pat buvo nustatyta APP poveikis redukuoto ir oksiduoto glutationo (GSH ir GSSG) kiekiui hepatomos ląstelėse, esant skirtingoms temperatūroms (37, 38, 42 ir 45oC). Gauti gan netikėti glutationo koncentracijos kitimo duomenys. Didžiausia visų formų glutationo koncentracija buvo nustatyta po poveikio 42°C hipertermija - bendra ir redukuoto glutationo koncentracija padidėjo apie 3 kartus, o oksiduoto – apie 10 kartų, lyginant su 37°C kontrole.Hyperthermia is the increased body temperature above the normal range at unimpaired thermoregulation. Hyperthermia may have different effects in combination with medications on cells and target organelles such as mitochondria function. Acetaminophen (APP, APAP or paracetamol), N-(4-hydroxyphenyl)-acetamide is a widely used analgetic-antipyretic drug. An overdose of APP causes liver damage mainly due to its toxic metabolite N-acetyl-p-benzochinono imines (NAPQI), which is detoxified by the reaction with GSH. Glutathione is a versatile tripeptide, ɣ-glutamylcysteine-glycine, found in many plants, micro-organisms and in mammalian tissues. Glutathione exists in reduced form (GSH) and oxidized disulfide form (GSSG). At large doses of APP cellular GSH is exhausted and NAPQI starts to bind covalently to proteins including mitochondrial proteins, what causes mitochondrial dysfunction or even cell death. Therefore, in this work we assessed the effect of hyperthermia, acetaminophen (APP) and its metabolite N-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI) on the amount of oxidized and reduced glutathione (GSSG and GSH) in isolated mitochondria and hepatoma cells. We evaluated the APP and NAPQI effects on oxidized and reduced glutathione (GSH and GSSG) levels in liver mitochondria at different temperatures (37, 42 and 45°C). We found that APP and hyperthermia reduces total, GSH and GSSG levels of glutathione. The biggest decrease was observed at 42°C hyperthermia. In this study we also measured the APP and NAPQI effects on mitochondrial respiration rates in metabolic state III (V3) at different temperatures (37, 39, 40, 42 and 45oC) using different substrates (P + M and G+ M). The results showed that the effect APP on V3 using G+ M was higher than on pyruvate oxidation at all the studied temperatures. These results suggest that glutamate oxidation enzyme system is more sensitive to APP. NAPQI significantly inhibited the V3 with P + M and the effect was slightly reduced by increasing with the temperature. Prior to gluthation assay APP effect on hepatoma cell viability and proliferation at characteristic fever (38°C) temperature was evaluated. The results showed that APP reduces cell viability, but APP effects hepatoma cell proliferation less than fever temperatures. APP effect on reduced and oxidized glutathione (GSH and GSSG) levels in hepatoma cells at different temperatures (37, 38, 42 and 45oC). Was rather unexpected. The largest amount of all forms of glutathione was observed after exposure at 42 ° C hyperthermia - the total and reduced glutathione levels were increased approximately 3-fold and oxidized - about 10 times as compared to 37 °C control.Vytauto Didžiojo universiteta