The formation of organic monolayers by spin coating for the detection of enzymatic lipase activity

Šiame darbe tirtas lipazės iš Thermomyces lanuginosus (TLL) fermentinis aktyvumas. Substratu naudotas 1,16-di(5-ferocenilpentanoiloksi)heksadekanas yra redokso aktyvus lipazės substratas jautrus jos fermentiniam veikimui. Elektrocheminiais metodais nustatytos šio fermento aktyvumo detektavimo optimalios sąlygos (35 oC temperatūra, pH = 7), ištirta fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo TLL koncentracijos (didėjant TLL koncentracijai reakcijos greitis didėja, kol substrato paviršius įsotinamas fermentu), įvertintos kitos galimos elektrocheminio signalo kitimo priežastys bei įrodytas fermentinis hidrolizinis veikimas panaudojant TLL mutant��� S146A. ATR–FTIR metodu įrodyta, kad TLL molekulės adsorbuojasi ant organinio hidrofobinio sluoksnio ir kad ši adsorbcija yra negrįžtama. Nustatyta TLL adsorbcijos izoterma. Remiantis elektrocheminių, ATR–IR PPR spektroskopijos metodų rezultatais apskaičiuota TLL katalitinė konstanta.In this work, the enzymatic activity of lipase from Thermomyces lanuginosus (TLL) was assessed using the electrochemical cyclic voltammetry and redox active 1,16–di(5–ferrocenylpentanoyloxy)hexadecane as a substrate. The TLL activity was measured by the redox signal decay upon lipase injection into the cell. The enzymatic nature of the signal decay was demonstrated by using protein engineered mutant variant S146A. The optimal conditions for the assay were found to be at 35 oC and pH = 7, and the enzymatic ester bond cleavage rate as a function from TLL concentration was established. ATR–FTIR spectroscopy demonstrated the irreversible nature of TLL adsorption on the substrate surface. The adsorption isotherm of TLL has been established. Using the electrochemical, ATR–IR and SPR spectroscopy data the catalytic constant of TLL was found.Švietimo akademijaVytauto Didžiojo universiteta