Glioblastoma multiforme molecular biomarkers study using combined MGMT, NDRG2 and PROM1/CD133 genes promoter methylation and mRNA expression analysis

Glioblastomos yra dažniausia ir piktybiškiausia pirminio žmogaus smegenų naviko forma, pasižyminti įvairiais genetiniais pakitimais, kurie sutrikdo ląstelės ciklo bei augimo, apoptozės, kraujagyslių bei ląstelių proliferacijos procesus. Epigenetiniai pakitimai įvardijami kaip vieni iš svarbiausių etiologinių veiksnių glioblastomų atsiradime, kurių metu keičiama įvairių su vėžio ekspansija susijusių genų raiška. Dabartinis naviko gydymas apsiriboja chemo ar radioterapija bei chirurgine intervencija, tačiau genetinių ir epigenetinių pakitimų mechanizmų supratimas ląstelėse bei jų sąsaja su etiologija yra reikalingas, norint tiksliau įvardinti diagnozę. Tam tikrų genų promotoriaus metilinimas navike gali būti sėkmingai panaudotas glioblastomų gydyme, padidinant navikinių ląstelių jautrumą chemo ar radioterapijai. Geriausiai žinomas pavyzdys yra O6-metilguanino-DNR metiltransferazės (MGMT) promotoriaus metilinimo nustatymas bei ligos gydymas alkilinančiais junginiais. Šio tyrimo tikslas buvo, atlikus MGMT, NDRG2 ir PROM/CD133 genų promotorių metilinimo ir raiškos tyrimus, panaudojant pacientų demografinius duomenis įvertinti potencialių molekulinių žymenų tinkamumą glioblastomų tipavimui. Tyrimo metu išskirta genominė DNR buvo modifikuojama bisulfito metodu. Promotoriaus metilinimas buvo nustatomas metilinimui jautria PGR – MSP. Genų raiška įvertinta panaudojant kiekybinį atvirkštinės transkriptazės realaus laiko PGR SYBR Green I metodą. Tyrimo metu buvo ištirta 40 glioblastoma sergančių pacientų auglio mėginių. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp raiškos MGMT geno metilinimo grupėse (p=0,0384), tačiau geno raiškos skirtumo tarp metilinimo grupių nebuvo aptikta NDRG2 atveju (p=0,723). Nustatyta, kad PROM1 geno raiška patikimai skyrėsi tarp metilintos ir nemetilintos grupių (p=0,0249), tačiau dėl mažos grupės imties greižtų išvadų reikėtų vengti. MGMT metilinimo ir pacientų išgyvenamumo analizė parodė patikimą ryšį tarp kintamųjų (p=0,041) ir tai rodo, kad GBM pacientai, turintys metilintą MGMT geno promotorių, turi didesnę tikimybę išgyventi ilgiau nei nemetilintoje grupėje. Reikšmingų sąsajų tarp geno metilinimo ir išgyvenamumo NDRG2 ir PROM1 atvejais nustatyta nebuvo, atitinkamai p=0,568 ir p=0,264. iRNR raiškos ir tiriamųjų išgyvenamumo analizė taip pat neparodė ryšio tarp kintamųjų nei vieno tirto geno atveju (p>0,05). Tyrimo rezultatai parodė, kad analizės indikatorius – MGMT genas – patvirtino tyrimo korektiškumą, rezultatai neprieštarauja kitų tyrėjų duomenims. Pilotinis NDRG2 ir PROM1 genų molekulinių ir tiriamųjų demografinių duomenų tyrimas parodė, kad pasirinkti genai buvo informatyvūs molekuliniai žymenys atskiriant normalių smegenų audinį ir glioblastomos audinį, tačiau nebuvo pakankamai informatyvūs molekuliniai žymenys, kurie padėtų skirstyti glioblastomas į skirtingas prognostines ar/ir gydymo grupes.Glioblastoma (GBM) is the most common aggressive and lethal cancer, accounting for the majority of primary brain tumors in adults. GBM is characterized by various genetic alterations, affecting genes that control cell growth, apoptosis, angiogenesis, and invasion. Epigenetic alterations also affect the expression of cancer genes alone, or in combination with genetic mechanisms. Given the resistance of glioblastoma to standard treatment, the deeper understanding of the underlying genetic and epigenetic lesions is vital. Epigenetic findings begin to influence the application of treatment to patients with glioblastoma. Promoter hypermethylation can modulate sensitivity to chemotherapy and radiotherapy in glioblastoma. O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter methylation determining the response to DNA alkylating agents is the best known illustration. The aim of this investigation was to verify potential molecular marker suitability for GMB typing, using promoter methylation and gene expression findings of MGMT, NDRG2 and PROM1/CD133 genes, (using surgical material) and patients’ demographical data. Genomic DNA from GBM tissue was bisulfite modified. Promoter methylation was detected by methylation specific PCR (MSP). Gene expression study was performed using quantitative RT-PCR SYBR Green I analysis in 3 replicates. In this study 40 glioblastoma patients were analyzed. In the MGMT gene case gene expression level differed significantly between groups of different gene promoter methylation status (p=0.0384), but not in NDRG2 gene case (p=0.723). PROM1 gene expression was found to be significantly different between methylated and unmethylated groups (p=0.0249). MGMT methylation and patients’ survival analysis showed significant association (p=0.0409), which means, that GMB patients’ with methylated MGMT gene promoter have better outcome after surgery. No significant correlation between NDRG2 and PROM1 genes methylation and patients’ survival was found (p=0.568; p=0.264 resp.). mRNR expression and patients survival analysis didn’t show any significal correlation (p>0.05) in all gene cases. Investigation results showed that analysis indicator – MGMT gene – worked properly, and the results are not against other published data. Pilot study of NDRG2 and PROM1 genes molecular and patients’ demographical data showed that analyzed genes were rather informative to discriminate between normal brain and glioblastoma tissue, but not informative enought as markers for GBM patient stratification.Vytauto Didžiojo universiteta