Evaluación de estrategias terapéuticas basadas en sustancias antiinflamatorias y antioxidantes en retinosis pigmentaria

La retinosis pigmentaria comprende un grupo de distrofias hereditarias de retina, caracterizadas por la pérdida progresiva e irreversible de la visión, debida a la muerte de las células fotorreceptoras. Se trata de una enfermedad rara, que constituye la principal causa genética de ceguera, con una prevalencia de un afectado por cada 4000 habitantes. Mientras que la degeneración retiniana empieza con la muerte de los bastones debida a mutaciones genéticas, la muerte de los conos parece ser consecuencia de un progresivo daño oxidativo, inflamación y desequilibrio metabólico, influenciado por la liberación de sustancias tóxicas por parte de los bastones y otras células del entorno. La muerte de los bastones da lugar a la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad, como la ceguera nocturna y la visión en túnel, y la muerte de los conos termina produciendo la perdida de la visión central. Los fotorreceptores son especialmente susceptibles al daño oxidativo y a la peroxidación lipídica debido a su elevada tasa metabólica y a los riesgos ambientales a los que están expuestos. Distintas evidencias en modelos experimentales y pacientes con retinosis pigmentaria muestran alteraciones en el estado antioxidante-oxidante y presencia de estrés oxidativo que pueden correlacionarse con una peor función visual. Según esta hipótesis oxidativa, la muerte de los bastones, principales consumidores de oxígeno de la retina durante las primeras etapas de la enfermedad, provocaría un aumento de la concentración de oxígeno o hiperoxia, que produciría estrés oxidativo, exacerbando la muerte de los bastones y contribuyendo a la muerte de los conos. En los últimos años también se ha observado una gran implicación de la inflamación en la progresión de la enfermedad, que conlleva activación de la microglía y conduce a la liberación de citoquinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral (TNFα), entre otras moléculas de señalización. El mantenimiento prolongado de elevados niveles de estas moléculas, especialmente de las citoquinas, puede acelerar el propio proceso de degeneración de la enfermedad. Actualmente, no existen terapias efectivas para el tratamiento de la retinosis pigmentaria, por lo que el objetivo general de esta tesis es abordar diferentes estrategias farmacológicas para el tratamiento de la enfermedad, intentando actuar sobre los diferentes procesos que ocurren durante el proceso de degeneración retiniana y ralentizar así su avance. Para ello, en primer lugar, corroboramos la presencia de marcadores inflamatorios en pacientes y en ratones con retinosis pigmentaria. A continuación, evaluamos el efecto de la administración intravítrea de Adalimumab, un anticuerpo anti-TNFα, sobre la degeneración retiniana en un modelo murino de retinosis pigmentaria, el ratón rd10, profundizando en los mecanismos de muerte implicados en el proceso de degeneración. Los estudios in vitro sugieren que el TNFα induce la activación de las poli (ADP) ribosa polimerasas (PARPs) y de caspasas, el aumento de la proteína RIPK3 (receptor-interacting protein) y la disminución de RIPK1 en fotorreceptores de ratón. Los estudios in vivo sugieren que la muerte celular en la retina de los ratones está medida por activación de PARP y del inflamasoma NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3), y, en menor medida, por los mecanismos dependientes de caspasas a día postnatal 23. El tratamiento con Adalimumab intravítreo reduce la degeneración retiniana, disminuyendo la activación de PARP, de la microglía y del inflamasoma NLRP3. Además, con las inyecciones intravítreas conseguimos aumentar la ventana terapéutica con respecto a la administración intraperitoneal, pues el efecto neuroprotector del tratamiento se observa durante más tiempo en los ratones. En tercer lugar, evaluamos el efecto de la estabilización del factor 1 de transcripción inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-1α) en el ratón rd10. Los resultados de este estudio muestran una disminución generalizada de la proteína HIF-1α y sus genes diana, lo que sugiere que la retina se encuentra expuesta a un ambiente hiperóxico durante el proceso de degeneración. El tratamiento con dimetiloxalil glicina (DMOG) disminuye la degeneración y la inflamación en la retina de los ratones, demostrando así el efecto neuroprotector de la estabilización de HIF-1α sobre los procesos de degeneración retiniana en etapas tempranas de la retinosis pigmentaria. Por último, evaluamos el efecto sobre el estado antioxidante-oxidante y la función visual de pacientes con retinosis pigmentaria, de la administración oral de una mezcla de nutracéuticos antioxidantes. Basalmente observamos un desequilibrio del estado redox ocular y en menor grado sistémico. El tratamiento con la mezcla de nutracéuticos antioxidantes durante dos años, evita el empeoramiento de la función visual y produce una ligera mejoría del estado redox ocular, aunque no observamos efecto significativo sobre los marcadores del estado redox en sangre. En conclusión, nuestros resultados confirman que existen alteraciones en el sistema antioxidante, los procesos inflamatorios y la biodisponibilidad de oxígeno a nivel ocular, implicadas en la patogénesis de la retinosis pigmentaria. Además, sugieren que reduciendo algunos de estos procesos como la inflamación o el estrés oxidativo es posible ralentizar la progresión de la degeneración de la retina, con la ventaja de ser estrategias farmacológicas independientes del defecto genético causante de la retinosis pigmentaria.Retinitis pigmentosa comprises of a group of inherited retinal dystrophies, characterized by the progressive and irreversible loss of vision due to the death of photoreceptor cells. It is a rare disease, which is the main genetic cause of blindness, with a prevalence of one affected per 4000 inhabitants. While retinal degeneration begins with the death of the rods due to genetic mutations, the death of the cones appears to be the result of progressive oxidative damage, inflammation, and metabolic imbalance, influenced by the release of toxic substances by photoreceptors and other surrounding cells. Rod death results in the appearance of the first symptoms of the disease, such as night blindness and tunnel vision, and cone death ends up causing the loss of central vision. Photoreceptors are particularly susceptible to oxidative damage and lipid peroxidation due to their high metabolic rate and the environmental risks to which they are exposed. Different evidence in experimental models and patients with retinitis pigmentosa show alterations in the antioxidant-oxidant status. Moreover, the presence of oxidative stress could be correlated with a worse visual function. Photoreceptor cells are the main consumers of oxygen in the retina. According to this oxidative hypothesis, rod death during the early stages of the disease would cause an increase in the concentration of oxygen or hyperoxia, which would produce oxidative stress. This oxidative stress would exacerbate rod death and contribute to cone death. A strong implication of inflammation has been also proposed for the progression of the disease. Inflammation would lead to the activation of microglia that releases pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor (TNFα), among other signalling molecules. Prolonged maintenance of high levels of these molecules, especially cytokines can speed up the process of disease degeneration itself. Currently, there are no effective therapies for the treatment of retinitis pigmentosa. Therefore, the main purpose of this thesis is to address different pharmacological approaches acting on the different inflammatory ad oxidative stress processes that occur during the retinal degeneration process to slow down the degeneration. First, we corroborated the presence of inflammatory markers in patients and mice with retinitis pigmentosa. We then evaluated the effect of the intravitreal administration of Adalimumab, an anti-TNFα antibody, on the retinal degeneration of a model of retinitis pigmentosa, the rd10 mouse, delving into the death cell mechanisms involved in the degenerative process. In vitro studies suggest that TNFα induces the activation of poly (ADP) ribose polymerases (PARPs) and caspases, increased RIPK3 (receptor-interacting protein) and decreased RIPK1 in 661W cells (cell line of murine cones). In vivo studies suggest that the photoreceptor cell death is mediated by the activation of PARP and NLRP3 inflammasome (NOD- LRR- and pyrin domain-containing protein 3), and, to a lesser extent, by caspase dependent mechanisms at postnatal day 23 in rd10 mice. Treatment with intravitreal Adalimumab reduced retinal degeneration, decreasing the activation of PARP, microglia and NLRP3 inflammasome. Therefore, a single intravitreal injection of Adalimumab improved the neuroprotective effect previously observed after several intraperitoneal injections, increasing the therapeutic window. Third, we evaluated the effect of the hypoxia-inducible transcription factor 1 alpha (HIF-1α) stabilization in rd10 retinas. The results of this study showed a generalized decrease in the HIF-1α protein and its target genes, suggesting that the retina is exposed to a hyperoxic environment during the degenerative process. Treatment with dimethylhoxalyl glycine (DMOG) slowed down the degeneration and inflammation in rd10 retina at postnatal day 18 and lesser to extent at postnatal day 23, thus demonstrating the neuroprotective effect of HIF-1α stabilization at early stages of retinitis pigmentosa. Finally, we evaluated the effect of oral administration of a mixture of nutraceutical with antioxidant properties on the ocular redox status and the visual function of patients with retinitis pigmentosa. The baseline values of several markers of redox status indicated an imbalance of the ocular redox status and, in a lesser extent to systemic redox status in patients compared to healthy subjects. The treatment with the mixture of nutraceutical for two years, partly prevented the worsening of visual function and produced a slight improvement of the ocular redox status. We did not observe significant effect on the redox status in blood. In conclusion, our results indicate that there are alterations in the antioxidant system, inflammatory processes and the retinal bioavailability of oxygen that would be involved in the pathogenesis of retinitis pigmentosa. In addition, these results suggest that it is possible to slow down the retinal degeneration by reducing, at least in part, some of these inflammatory or oxidative stress processes. These therapeutic approaches take the advantage of being strategies independent of the genetic defect causing retinitis pigmentosa