草鱼serpin基因家族成员的克隆及其表达研究

草鱼，作为一种具有巨大经济价值和分布广泛的重要水产养殖物种，对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)十分敏感，极易受到出血病的侵袭而出现大面积死亡的现象，这严重制约着草鱼的集约化养殖。丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibtor, serpin)属于蛋白酶抑制剂基因家族，涉及众多的生理和病理过程，特别是凝血和补体激活方面。然而目前为止，仅有草鱼serpinf1在脂肪炎症中的生物学功能略有研究。本研究中，我们通过基因组比对和RACE方法在草鱼中获得8个serpin基因家族成员的全长cDNA序列(serpina1, serpinb1, serpinc1, serpind1, serpine1, serpine2, serpinf2b和serping1)，并对它们进行了初步分析。主要研究结果如下： 1.对8个serpin基因的基因组序列和氨基酸序列结构进行分析，获得8个草鱼serpins基因家族成员的外显子和内含子序列结构及长度信息；鉴定出8个成员具有丝氨酸蛋白酶抑制剂代表性的活性反应中心环的断裂位点。 2.对DNA和氨基酸序列相似性进行比较分析，结果显示草鱼serpins序列与斑马鱼或鲤鱼相应serpin家族成员序列最为接近；系统发育的分子进化树显示草鱼、斑马鱼和鲤鱼三者的serpins基因在进化上的亲缘关系最为接近。 3.荧光定量PCR显示这些serpins具有组织差异性表达的特点。其中serpina1, serpinc1, serpind1, serpinf2b和serping1在肝脏有最高的mRNA表达水平。 4.GCRV-GD108感染后，serpina1, serpinc1, serpind1和serping1在肝脏中的表达谱经历了一个先上调后下调的表达过程；serpinf2b的表达量在GCRV感染的前8天整体上明显呈低水平表达,在第8天后略有上调表达。 5.GCRV感染后第8天开始，抗凝血因子(serpinc1, serpind1, thrombomodulin, PROC和PROS)在肝脏中的表达量呈下调表达的趋势，但凝血途径的起始激活因子f3b及与之形成复合物的另一重要凝血因子f7则从第8天开始呈上调表达的趋势，而凝血途径的起始激活因子f3a从第11天开始呈现上调表达的趋势。 6.经典途径的起始激活物C1qB和C1qC在GCRV感染后的早期在mRNA水平上呈低水平表达，从第4天开始上调表达。凝集素途径的标志物MBL基因在GCRV感染后的第1天即上调表达且在整个GCRV感染过程中与初始表达水平相比都呈上调表达。而旁路途径的相关补体成分主要在GCRV感染后的第1天到第5天呈上调表达。三条补体通路的共有成分都发生了较为明显的表达变化。此外，C1qB和C1qC表达谱与serping1(补体C1抑制剂)的表达谱在整个GCRV感染过程中呈负相关性。 7. 成功获得gcserpina1, gcserpine1和gcserpine2原核表达的纯化蛋白。 上述研究结果表明：serpins参与了草鱼响应GCRV感染过程。从草鱼感染GCRV后的第8天开始，抗凝血因子(serpinc1, serpind1, thrombomodulin, PROC和PROS)在肝脏中的表达量呈下调表达的趋势，但凝血途径的起始激活物因子f3a和f3b及与之形成复合物的另一重要凝血因子f7则呈上调表达的趋势，意味着凝血途径可能再次被活化。此外，plasmin和PROC的抑制剂serpinf2b从第8天开始呈现上调表达，这表明在GCRV感染后期serpinf2b可能削弱了plasmin和PROC的抗凝血活性。GCRV-GD108感染后，补体旁路途径可能主要在GCRV感染早期发挥作用，经典途径可能主要在GCRV感染后期发挥作用，而凝集素途径可能在整个GCRV胁迫过程中都发挥了作用。此外，作为补体C1抑制剂的serping1和C1qB以及C1qC之间的负相关性表达提示serping1对C1qB以及C1qC可能具有抑制功能。总的说来，本研究为进一步研究serpins基因在GCRV破坏草鱼血液系统和发挥免疫功能方面提供了初步的见解。