Probioottisten bakteerien elävyyden osoittaminen fluoresenssitekniikoilla

Työn tavoitteena oli tutkia fluoresenssitekniikoiden soveltuvuutta probioottisten bakteerien elävyyden osoittamiseen puhdasviljelmissä ja mehutuotteissa. Työn kirjallisuusosassa tarkasteltiin probioottisia bakteereita, mikrobien elävyyden määrityksessä käytettyjä fluoresenssitekniikoita ja fluoresoivia värejä sekä virtaussytometrian soveltamista mikrobien määritykseen puhdasviljelmistä ja elintarvikkeista. Tutkimusosan ensimmäisessä vaiheessa tutkittiin fluoresenssimikroskopiaan perustuen Lactobacillus rhamnosus VTT E-96666 -, Lactobacillus reuteri VTT E-97849 -, Lactobacillus paracasei VTT E-94510 -, Lactobacillus plantarum E-981065 - sekä Bifidobacterium lactis VTT E-94508 -puhdasviljelmien värjäytyvyyttä kuudella erilaisella fluoresoivalla värillä. Puhdasviljelmien värjäyksissä hyväksi todettuja värejä käytettiin mehujen sisältämien probioottisten bakteerien määritykseen. Tutkimusosan toisessa vaiheessa tutkittiin virtaussytometrian soveltuvuutta fluoresoivilla väreillä värjättyjen bakteerien määritykseen puhdasviljelmistä ja mehuista. Tutkituista fluoresoivista väreistä solumembraanin eheyttä mittaava BacLight LIVE/DEAD (Molecular Probes) ja solunsisäiseen esteraasiaktiivisuuteen perustuva Chemchrome (Chemunex), värjäsivät kaikki tutkitut bakteerikannat. Bakteerikannan ominaisuudet ja värjäysolosuhteet vaikuttivat solujen värjäytymiseen esteraasiväreillä. Membraanivaurioisiin soluihin tunkeutuva propidiumjodidi ei ollut luotettava väri kuolleiden solujen määrityksessä. Puhdasviljelmien perusteella valitut esteraasivärit värjäsivät myös mehujen sisältämät probioottiset bakteerit, mutta vastaavia puhdasviljelmiä heikommin. BacLight LIVE/DEAD ei runsaan taustafluoresenssin vuoksi ollut hyvä väri mehujen sisältämien bakteerien tarkastelussa. Virtaussytometrilla erotettiin elävät bakteerit puhdasviljelmistä ja mehuista, vaikka mehuissa oli solujen lisäksi muuta fluoresoivaa materiaalia. Propidiumjodidilla värjätyt, lämpökäsittelyllä tapetut bakteerit eivät selkeästi erottuneet virtaussytometrilla, mutta ne voitiin todeta fluoresenssimikroskoopilla. Vrtaussytometria oli fluoresenssimikroskopiaa herkempi menetelmä fluoresoivien kappaleiden detektoinnissa. Elävien bakteerisolujen määrät olivat virtaussytometrian, fluoresenssimikroskopian ja viljelyn perusteella samaa suuruusluokkaa. Virtaussytometriaan ja fluoresenssimikroskopiaan perustuvat elävyyden määritykset olivat toteutettavissa tunnissa, kun viljelyyn tarvittiin 1-2 d. Fluoresenssitekniikoita voidaan käyttää probioottisten bakteerien elävyyden määritykseen. Fluoresoivat värit ja värjäysolosuhteet on valittava tutkittavan bakteerikannan mukaan. Virtaussytometriaa voidaan soveltaa elintarvikkeiden sisältämien bakteerien tutkimiseen, mutta laitteiston onnistunut käyttö edellyttää sopivien esikäsittely-, värjäys- ja analyysimenetelmien kehittämistä käyttökohteen mukaan