Assessment of Erwinia amylovora diversity and virulence: from strain molecular typing to immuno-flow cytometry of infected Pyrus fruits

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Erwinia amylovora is a phytopathogenic bacterium and the causative agent of fire blight, a destructive disease that affects several members of the Rosaceae family. Pear and apple are particularly susceptible hosts of this bacterium, representing a major concern due to their socioeconomic value. The devasting nature of this disease has led to the classification of E. amylovora as a quarantine organism. Although this bacterium is widespread throughout the world, its emergence in Portugal happened relatively recently when compared to other European countries. Since its first report in 2006 in Fundão region, the number of outbreaks has increased, leading Portugal to loss its statute of Integral Protected Area within the European Union, in 2019. Factors such as the absence of a cure, false-negatives results and the need to understand unknown aspects about the life cycle of E. amylovora, lead to the interest in conducting characterization studies and developing alternative laboratory methods as an attempt to make preventive measures more effective. A set of Portuguese and foreign E. amylovora isolates was characterized by molecular, pathogenicity and virulence studies. Molecular characterization used CRISPR-PCR and genomic fingerprintings, whereas pathogenicity and virulence were assessed by biological tests on immature fruitlets of Pyrus communis cv. “Rocha”. In addition, a flow cytometry and an immuno-flow cytometry protocols were developed using pure and mixed bacterial cultures for the detection and cell viability assessment of E. amylovora in planta. A total of two CRISPR genotypes, A and D, was observed revealing a low genetic diversity among the E. amylovora isolates tested. Genomic fingerprinting reinforced the high homogeneity of this species. In contrast, a wide diversity in virulence was displayed. Flow cytometry and immuno-flow cytometry protocols were validated, revealing the capacity to detect and distinguish different viability states of E. amylovora artificially inoculated in pear fruitlets. In the future, the established protocols may help shed some light over previously undiscovered aspects of E. amylovora life cycle.Erwinia amylovora é uma bactéria fitopatogénica Gram-negativa responsável pela doença comummente denominada por fogo bacteriano. A designação desta doença está relacionada com o desenvolvimento de necroses de cor castanha a preta no hospedeiro durante o processo de infeção, cuja aparência se assemelha a uma queima. Outros sintomas típicos incluem o surgimento de lesões, exsudado bacteriano, cancros nos ramos e tronco, bem como de mumificação dos frutos. Originalmente nativa da América do Norte, E. amylovora foi detetada pela primeira vez no final do século 18. Atualmente, por consequência da ação humana, a doença está amplamente disseminada pelo globo. Devido à elevada capacidade de propagação e ao efeito potencialmente devastador para os seus hospedeiros, E. amylovora foi classificada como um organismo de quarentena. Os hospedeiros desta bactéria pertencem à família Rosaceae, na qual estão inseridos géneros de plantas agrícolas importantes a nível socioeconómico, tais como Malus e Pyrus, Em Portugal, a presença de fogo bacteriano foi reportada pela primeira vez em 2006 no Fundão, data relativamente tardia aquando comparação do surgimento da doença nos restantes países da Europa. Desde então, a ocorrência de situações reportadas em várias regiões do país tem vindo a aumentar, fazendo com que o país perdesse o estatuto de Zona Integral Protegida na União Europeia em 2019. Alguns fatores que tornam esta doença preocupante são a inexistência de cura e o desconhecimento de alguns aspetos do ciclo de vida de E. amylovora. Assim, são aplicadas estratégias de controlo que incluem abordagens complementares, tais como medidas preventivas, profiláticas e de erradicação. Outro fator preocupante é a ocorrência de resultados falso-negativos aquando aplicação dos métodos utilizados para o diagnóstico desta bactéria. Estes podem dever-se a uma concentração bacteriana insuficiente ou à indução do estado viável não cultivável em E. amylovora, o qual pode estar associado, por exemplo, a condições climáticas adversas e à utilização de compostos cúpricos como medida profilática. Um diagnóstico errado pode conduzir à falta de aplicação de medidas de controlo e, consequentemente, acarretar consequências catastróficas. O presente trabalho teve dois objetivos. O primeiro consistiu na caracterização de um conjunto de isolados de Erwinia amylovora da Coleção Portuguesa de Bactérias Fitopatogénicas através de estudos genómicos, de patogenicidade e de virulência. O segundo compreendeu o desenvolvimento e validação de protocolos de citometria de fluxo e de imuno-citometria de fluxo, para servirem como método de diagnóstico alternativo na deteção e avaliação da viabilidade celular de populações de E. amylovora presentes em material infectado. Um total de 48 isolados de E. amylovora foram caracterizados genotipicamente a partir da utilização CRISPR-PCR e de fingerprintings genómicos, nomeadamente rep- e MSP-PCR. A patogenicidade e virulência destes isolados foram caracterizadas a partir da utilização de frutos imaturos de Pyrus communis cv. “Rocha”, os quais foram artificialmente infetados por um subconjunto dos 48 isolados. Após 6 e 12 dias de infeção, foram registados o tamanho da lesão necrótica e a presença/ausência de exsudado bacteriano, respetivamente. Para avaliação da viabilidade celular de E. amylovora por citometria de fluxo, foram testados três fluoróforos diferentes, nomeadamente Syto9, PI e DIBAC4(3). Estes foram aplicados em células tratadas por calor e em células não tratadas. A aplicação do protocolo de imuno-citometria de fluxo compreendeu o uso do anticorpo monoclonal Ea7A IVIA e de um anticorpo secundário conjugado com FITC. Ambos os protocolos foram testados primeiramente numa cultura pura de E. amylovora e posteriormente em culturas mistas. Por fim, os dois protocolos foram implementados na deteção e avaliação de viabilidade celular de E. amylovora presente em peras imaturas cv. “Rocha” infetadas artificialmente. A técnica CRISPR-PCR permitiu diferenciar os isolados em dois grupos consoante a presença ou ausência da duplicação do spacer 1029, nomeadamente em genótipo A e genótipo D, respetivamente. A análise dos isolados Portugueses permitiu verificar que ambos os genótipos estão presentes no país desde 2010 e que existe uma ligeira predominância do genótipo D, o qual foi registado em 17 dos 31 isolados. Em termos de distribuição, observou-se que o genótipo A e D estão presentes nas regiões Centro e Oeste de Portugal, contudo no Alentejo só se verificou a presença do genótipo A. Aquando análise conjunta de resultados de estudos prévios com os que foram obtidos no presente trabalho, verificou-se que o genótipo A é o genótipo mais distribuído na Europa, possivelmente devido à introdução mais precoce do mesmo no continente Europeu. As técnicas de fingerprinting genómico utilizadas, nomeadamente rep- e MSP-PCR, permitiram a obtenção de perfis genómicos complexos, mas muito homogéneos entre si. Desta forma, os mesmos mostraram não ter poder discriminatório suficiente para a diferenciação dos isolados de E. amylovora a nível infraespecífico. Estes resultados são o reflexo de uma variedade genómica limitada característica desta espécie bacteriana, que culmina numa elevada homogeneidade entre os isolados. Os ensaios em peras imaturas revelaram que, à excepção dos isolados CPBF 142 e CPBF 544, 43 isolados são patogénicos, uma vez que possuíram a capacidade de induzir o aparecimento de pelo menos um dos sintomas típicos do fogo bacteriano no hospedeiro. Todos os isolados patogénicos provocaram lesão necrótica de cor castanha a preta, contudo apenas 28 isolados produziram exsudado bacteriano. A análise destes sintomas permitiu observar variabilidade na virulência, de tal modo que os isolados foram distribuídos em três categorias de virulência, nomeadamente baixa, média e alta. Estas categorias tiveram em consideração o tamanho da lesão necrótica provocada no hospedeiro. Adicionalmente, observou-se a existência de correlação entre a categoria de virulência baixa e o genótipo D. Os dados de CRISPR-PCR, patogenicidade, virulência e presença/ausência de exsudado bacteriano foram agrupados para uma análise polifásica de modo a adquirir mais informação acerca dos isolados. Os dados obtidos por fingerprinting genómico não foram considerados, uma vez que não tiveram o poder discriminatório adequado. A utilização desta abordagem permitiu separar os isolados em 11 grupos de estirpes distintos. Contudo, não foi possível fazer uma associação entre estes grupos e o hospedeiro original a partir do qual cada isolado foi obtido. Relativamente à citometria de fluxo, a utilização dos fluoróforos permitiu a distinção de diferentes populações relativamente à integridade celular e potencial membranar presentes na cultura pura de E. amylovora. De facto, esta técnica apresentou uma boa correlação entre a viabilidade esperada e a observada, o que significa que os três fluoróforos se mostraram apropriados para serem utilizados em estudos de viabilidade celular nesta bactéria. O estudo de viabilidade celular de E. amylovora em cultura mista ficou comprometido devido ao comportamento semelhante que as bactérias podem ter face aos fluoróforos. O protocolo de imuno-citometria de fluxo permitiu detetar E. amylovora em cultura pura a partir da observação de uma elevada intensidade de fluorescência verde. Em cultura mista, para além da intensidade de fluorescência verde característica de E. amylovora, verificou-se também a ocorrência de uma emissão de fluorescência verde menor que se supõe que resulte de ligações inespecíficas entre o anticorpo secundário e outros alvos que não o anticorpo monoclonal Ea7A IVIA. Contudo, uma vez que a intensidade da emissão de fluorescência verde adicional foi reduzida, a mesma não impossibilitou a detecção de E. amylovora. O presente estudo reforçou a paradoxalidade existente entre a homogeneidade genómica e a heterogeneidade de virulência em Erwinia amylovora. Adicionalmente, o mesmo mostrou que o desenvolvimento de um potencial método alternativo para a detecção desta bactéria, nomeadamente com recurso a citometria de fluxo e técnicas afins, pode significar uma melhoria considerável no processo de diagnóstico, bem como abrir portas para descobertas futuras relacionadas com o ciclo de vida de E. amylovora