MicroRNAs with a key role in the Drosophila melanogaster immune response to bacteria

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020O sistema imunitário é responsável por uma eficiente neutralização de agentes infeciosos e toxinas, que põem em risco o estado de saúde de um indivíduo. Frequentemente, a resposta imune é descrita como tendo duas componentes: imunidade inata e adaptativa. Insetos, tal como Drosophila melanogaster, dependem apenas de estratégias de defesa inatas para eliminar patogéneos e possíveis danos que resultam de uma infeção. Mecanismos inatos são ativados após o reconhecimento de padrões moleculares conservados em micróbios, levando a uma resposta coordenada e eficiente. Esta resposta imune apresenta semelhanças com organismos de maior complexidade, sendo D. melanogaster o foco de estudo de trabalhos de investigação sobre imunidade inata. Na natureza, D. melanogaster está exposta a um conjunto diverso de patogéneos cuja principal via de infeção é por ingestão oral. Como tal, a primeira linha de defesa no hospedeiro é ao nível dos tecidos epiteliais, que em si são uma barreira física a invasões microbianas. As células do epitélio gastrointestinal têm defesas locais adicionais em resposta a infeções, tais como a produção local de péptidos antimicrobianos (AMPs, do inglês antimicrobial peptides) e espécies reativas de oxigénio (ROS, do inglês reactive oxygen species). Quando os agentes infeciosos são capazes de subsistir à ação destes mecanismos e infiltrar a cavidade corporal do inseto, induzem a produção sistémica de AMPs no corpo adiposo pelas vias de sinalização Toll e Imd (do inglês immunodeficency). Enquanto a via Toll é ativada por reconhecimento imune de fungos e bactérias Gram-positivas, a via Imd é induzida na presença de bactérias Gram-negativas. A coordenação entre a resposta imune local e a sistémica é estabelecida por células imunes especializadas denominadas de hemócitos. Estas células migratórias são importantes vigilantes imunes, contribuindo também para a remoção de micróbios por fagocitose e mecanismos de reparação de tecido. A sobrevivência do hospedeiro num contexto de infeção é dependente do dano infligido pelo patogéneo nos seus tecidos e função metabólica. Além disso, mecanismos de defesa, como a produção ROS, também têm um impacto prejudicial nos tecidos do hospedeiro. Assim sendo, existem duas estratégias de sobrevivência para os quais mecanismos imunes contribuem. A primeira estratégia consiste na eliminação ou expulsão do agente infecioso, e inclui os chamados mecanismos de resistência. A segunda está relacionada com mecanismos de tolerância que previnem ou reparam o dano tecidual causado pela infeção, sem necessariamente atacar o patogéneo. De modo a manter uma resposta imune adequada, os organismos multicelulares evoluíram no sentido de possuírem reguladores eficientes do balanço entre mecanismos de resistência e tolerância. Ao nível da expressão génica, a resposta imune pode ser regulada pós-transcricionalmente por pequenas moléculas de RNA não codificantes tais como microRNAs (miRNAs). Estas sequências ligam-se a zonas complementares na região 3’ não traduzida (UTR, do inglês untraslated region) de transcritos alvo, inibindo a sua tradução ou promovendo o seu decaimento. Os miRNAs já foram envolvidos em vários processos biológicos de humanos e insetos, incluindo processos de desenvolvimento e metabolismo. Recentemente, miRNAs específicos foram implicados na expressão de péptidos antimicrobianos, mas estudos bioinformáticos sugerem que o potencial de regulação destas sequências abrange outros mecanismos da resposta imune. Este projeto tem como objetivo principal a identificação e caracterização de miRNAs com um papel importante na resposta imune de D. melanogaster. Para tal, investigou-se o impacto de uma infeção sistémica com Pseudomonas entomophila, uma bactéria entomopatogénica, em trinta e três linhas deletadas em miRNAs. Resultados prévios sugerem que este é um conjunto de miRNAs que têm um impacto significativo na sobrevivência de D. melanogaster após este tipo de infeção. A primeira abordagem consistiu em validar resultados anteriores, ao replicar um screen de sobrevivência dos mutantes de miRNA após infeção com P. entomophila. Paralelamente, mediu-se a carga bacteriana no momento da morte (BLUD, do inglês bacterial load upon death) para cada linha mutante. O estudo destes dois fenótipos permite identificar miRNAs que têm um impacto no desfecho final da infeção, e, portanto, na resposta imune do hospedeiro. Os nossos resultados mostram que catorze mutantes têm uma sobrevivência alterada após a infeção. Seis linhas mutantes – miR-11, -957, -955, -92a, -278 e -285 – têm um risco de mortalidade mais elevado que linhas controlo, revelando que estes miRNAs são importantes para uma defesa imune eficaz. A acção de oito miRNAs – miR-986, -959/960/961/962, -965, -1000, -966, -137, -2a-21/2a-1/2b-2, e -100/let7/125 – é prejudicial na infeção com P. entomophila, uma vez que os respetivos mutantes apresentam uma maior probabilidade de sobrevivência na sua ausência. Os resultados de BLUD mostram que alguns mutantes que têm a sobrevivência alterada também apresentam diferenças significativas na carga bacteriana quando sucumbem à infeção. Isto indica que mecanismos de resistência ou tolerância estão possivelmente afetados nas linhas mutantes. A segunda abordagem foi caracterizar os mecanismos pelos quais os miRNAs poderão influenciar a resposta imune. Neste sentido, estudou-se as interações patogéneo-hospedeiro com base na proliferação bacteriana ao longo da infeção. Isto foi feito em cinco linhas mutantes, cada uma com um fenótipo conjunto diferente de sobrevivência e BLUD. Esta análise permite compreender se a sobrevivência está de algum modo relacionada com alterações na resistência ao patogéneo, que é medida indiretamente como o inverso da carga bacteriana. A razão pela qual alguns mutantes não apresentam diferenças na proliferação de P. entomophila, sugere que mecanismos de resistência não contribuem para o fenótipo de sobrevivência que observamos em cada mutante. Nestes casos, interpretamos as alterações nos níveis de saúde do hospedeiro como resultado de mecanismos de tolerância, que contribuem para a sobrevivência do organismo sem necessariamente afetar a proliferação bacteriana. A ausência de miR-965 e miR-966 aumenta a probabilidade de sobrevivência do hospedeiro, sem, no entanto, influenciar o crescimento bacteriano. Estes dados sugerem que tanto o miR-965 como o miR-966 são inibidores da tolerância, visto que os mutantes respetivos apesar de terem a mesma quantidade de patogéneo, lidam melhor com o dano que advém da infeção. De um modo semelhante, a regulação do cluster miR-100/let-7/125 aparenta ser prejudicial para a tolerância de D. melanogaster ao patogéneo. Em fases finais da infeção, os mutantes do miR-11 e miR-955 apresentam uma capacidade diminuída de controlar a proliferação bacteriana e uma mortalidade mais elevada. Isto sugere que ambos os miRNAs são importantes para manter a resistência a P. entomophila. Em suma, este trabalho mostra que a regulação da expressão génica por miRNAs tem um papel impactante nas interações patogéneo-hospedeiro, refletindo-se em fenótipos distintos de sobrevivência. No futuro, será importante continuar a investigar a ação destes miRNAs, especificamente quais são os genes alvo desta regulação, e de que maneira a sua expressão afeta a imunidade de D. melanogaster.The immunity of Drosophila melanogaster is an efficient and multifaceted system, comprised of innate mechanisms that protect the host from pathogens it is naturally exposed to. In order to survive the action of infectious agents, D. melanogaster relies on two distinct strategies referred to as host resistance and disease tolerance. Resistance mechanisms consist of killing or expelling an immune elicitor, while tolerance mechanisms deal with the inevitable damage of infection. The adequate balance between the two is achieved by the action of effective regulators of the immune response, such as microRNAs (miRNAs). These small non-coding RNA molecules control gene expression at a post-transcriptional level, inhibiting the expression of target messenger RNAs (mRNAs). Although miRNA regulation is well characterized in biological processes such as development, we are just now starting to unravel their potential impact in D. melanogaster immunity. With this project we aimed to identify and characterize miRNAs with a key role in D. melanogaster immune response to bacteria. Our approach was to investigate the impact of systemic infection with Pseudomonas entomophila in a set of thirty-three miRNA knockout lines. Focusing on post-infection survival, we identified fourteen mutants that had significant differences from control lines. Six knockout lines – miR-11, -957, -955, -92a, -278 and -285 – had a higher mortality rate than control flies, suggesting that these miRNAs are important for the host immune response to P. entomophila. In contrast, eight miRNA candidates – miR-986, -959/960/961/962, -965, -1000, -966, -137, -2a-2/2a-1/2b-2, and - 100/let-7/125 – appeared to be detrimental for host defence against P. entomophila, since the respective miRNA knockout line had a significantly better chance of survival after infection. We decided to further characterize the role of five miRNA candidates, by studying host-pathogen interactions in the respective knockout lines. The absence of miR-965 and miR-966 increased the chances of host survival to infection, without impacting within-host bacterial proliferation. These data suggested that miR-965 and miR-966 are potential inhibitors of host tolerance against P. entomophila. In a similar way, the miR-100/let-7/125 cluster may be a potential inhibitor of host disease tolerance. Finally, in later stages of infection, miR-11 and miR-955 mutants showed an impaired ability to control bacterial proliferation, which suggests that both miRNAs are important for immune function maintenance during infection with P. entomophila. Our findings show that gene expression regulation by miRNAs can impact host-pathogen interactions, leading to distinct survival phenotypes in D. melanogaster