Estudo de ésteres de derivados do ácido benzóico com álcoois de cadeia longa como pró-fármacos destinados ao tratamento da tuberculose

Tese de mestrado, Química (Química) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A Tuberculose (TB) é uma doença infeciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis (MT). Em 2018, um total de 1,5 milhões de pessoas morreram com TB, constituindo uma das 10 principais causas de morte no mundo. Com o aparecimento da resistência aos fármacos de primeira linha contra a TB, como pirazinamida, isoniazida, rifampicina e etambutol, foi urgente a descoberta de novos agentes antimicobacterianos para combater estirpes MT resistentes. Uma abordagem interessante é o uso de pró-fármacos que demonstraram maior atividade biológica e que têm capacidade de ultrapassar dificuldades como a passagem pelas membranas celulares e a baixa absorção dos fármacos. Estudos realizados previamente mostraram que ácidos fracos tinham atividade antimicobacteriana significativa, que aumentava a pH ácido. Uma vez que os ácidos fracos apresentam, regra geral, dificuldades de absorção e uma forte ligação às proteínas plasmáticas, uma alternativa viável será o uso de ésteres de modo a superar as más propriedades farmacocinéticas dos ácidos. No entanto, para serem eficazes, devem ser resistentes à hidrólise no plasma humano e ativados dentro da micobactéria. Neste trabalho, foram sintetizados pró-fármacos ésteres de ácido benzóico (BA) com diferentes grupos eletroatratores, tais como 4-nitro (série 1), 3,5-dinitro (série 2), 4-(trifluorometilo) (série 3), 3,5-di(trifluorometilo) (série 4) e 2,3,4,5,6-pentafluoro (série 5). Ademais, utilizaram-se vários álcoois (propanol a tetradecanol) para se introduzirem grupos alquilo com diferentes comprimentos com a finalidade de modularem a absorção e resistência às esterases (Figura 0.1). Figura 0.1. Modo de ação dos ésteres propostos dos ácidos fracos. Depois de absorvidos pelas células de M. tuberculosis, os pró-fármacos são clivados pelas esterases micobacterianas, libertando o ácido livre. A estabilidade química e enzimática dos ésteres das séries 1 e 2 foi avaliada em tampão fosfato pH 7,4 a 37ºC e em plasma humano pela ativação das esterases (Figura 0.1). Posteriormente, estudou-se a atividade dos ésteres e ácidos derivados de BA contra M. tuberculosis H37Rv e determinaram-se as concentrações inibitórias mínimas (CIM) e as concentrações bactericidas mínimas (CBM). Por último, avaliou-se a citotoxicidade dos ésteres e dos ácidos procedendo à sua incubação em macrófagos THP-1 e determinaram-se as concentrações letais (CL50). Os ésteres foram sintetizados por diferentes métodos - A1, A2, A3 e B, tendo a síntese das séries 1 e 2 sido realizada com maior sucesso do que a das séries 3 a 5. Os rendimentos da síntese dos ésteres variaram entre 4 e 89%. Nos estudos de estabilidade, a componente hidrolítica química foi desprezada no estudo da estabilidade enzimática, uma vez que as percentagens de degradação de éster na hidrólise química foram muito reduzidas face às percentagens de degradação de éster na hidrólise enzimática. Ademais, concluiu-se que os 3,5-dinitrobenzoatos de alquilo foram mais estáveis na hidrólise enzimática que os 4-nitrobenzoatos de alquilo e menos estáveis na hidrólise química. Em relação à atividade antimicobacteriana, os ésteres de cadeia longa foram mais ativos que os respetivos ácidos; os ésteres com grupos nitro foram mais ativos que os ésteres fluorados e os 3,5-dinitrobenzoatos de alquilo foram os mais eficazes na eliminação de M. tuberculosis H37Rv. Relativamente à atividade bactericida, os 3,5-dinitrobenzoatos de alquilo 2g (C9) a 2j (C12) demonstraram ser possíveis fármacos antimicobacterianos bactericidas. Através da análise das relações estrutura-estabilidade/atividade, concluiu-se que a estabilidade dos ésteres aumentava com o aumento da lipofilia/comprimento do grupo alquilo e o efeito estereoquímico do grupo alquilo e a atividade aumentava com os substituintes nitro. Por último, o estudo da citotoxicidade dos derivados de BA em macrófagos demonstrou que os ésteres não foram tóxicos. Concluindo, oito 3,5-dinitrobenzoatos de alquilo 2e (C7) a 2l (C14) e quatro 4-nitrobenzoatos de alquilo 1g (C9) a 1i (C11) e 1k (C13) foram estáveis em plasma humano, ativos (maior atividade que os respetivos ácidos) e não tóxicos, pelo que estes ésteres mostraram ser possíveis candidatos a pró-fármacos antituberculosos.Tuberculosis (TB) is a disease caused by a Mycobacterium tuberculosis (MT). In 2018, a total of 1.5 million people died from TB and this disease is still one of the top 10 causes of death in the world. The emergence of resistance against the first line of TB drugs, such as pyrazinamide, isoniazid, rifampicin and ethambutol, has prompted the need of new antimycobacterial agents to combat TB drugs-resistant strains. One interesting approach is the use of prodrugs, that have often shown improved biological activities, being able to overcome poor absorption of drugs and difficulty crossing cell membranes. Previous studies demonstrated that weak acids have a significant antimycobacterial activity, which increases acidic pH. Weak acids have difficulties in absorption and a strong binding to plasma proteins, so a viable alternative to overcome the bad pharmacokinetic properties of acids could be the use of esters. However, in order to increase efficiency, they must by resistant to hydrolysis in human plasma and activated inside the bacteria. In this work, esters prodrugs of derivatives of benzoic acid (BA) containing different electron withdrawing groups on the aromatic ring, such as 4-nitro (series 1), 3,5-dinitro (series 2), 4-trifluoromethyl (series 3), 3,5-di(trifluoromethyl) (series 4) and 2,3,4,5,6-pentafluoro (series 5) were synthesized. In addition, several alcohols (propanol to tetradecanol) were used to introduce alkyl groups with different lengths to modulate the absorption and resistance to esterases (Figure 0.2). Figura 0.2. Mode of action of proposed esters of weak acids. After being absorbed by M. tuberculosis cells the prodrugs are cleaved by mycobacterial esterases, liberating the free acid. The chemical and enzymatic stability of these derivatives has been studied in a phosphate buffer pH 7.4 at 37ºC and in human plasma activated by esterases (Figure 0.2). After that, esters and acids derived BA activity against M. tuberculosis H37Rv was studied, through the quantification of minimum inhibitory concentrations (CIM) and minimum bactericidal concentrations (CBM) were determined. Finally, the cytotoxicity of esters and acids was evaluated by incubating them in THP-1 macrophages and lethal concentrations (CL50) were determined. The esters were synthesized by different methods - A1, A2, A3 and B, which the synthesis of series 1 and 2 was carried out with greater success than series 3 to 5. The yields of the ester synthesis varied between 4 and 89%. In stability studies, the hydrolytic chemical component can be neglected in the study of enzymatic stability, because the percentage of ester degradation in chemical hydrolysis was very low compared to the percentage of ester degradation in enzymatic hydrolysis. In addition, it was concluded that alkyl 3,5-dinitrobenzoates were more stable in enzymatic hydrolysis than alkyl 4-nitrobenzoates and less stable in chemical hydrolysis. Regarding the antimycobacterial activity, the long chain esters were more active than the respective acids; the esters with nitro groups were more active than the fluorinated esters and the alkyl 3,5-dinitrobenzoate were the most effective in eliminating M. tuberculosis H37Rv. Regarding bactericidal activity, alkyl 3,5-dinitrobenzoate 2g (C9) to 2j (C12) proved to be possible bactericidal antimycobacterial drugs. Through the analysis of structure-stability/activity relationships, it was observed that the stability of the esters increased with the increase of lipophilia, length and steric effect of the alkyl group and its activity increased with nitro substituents. Finally, the study of cytotoxicity of derivatives of BA in THP-1 macrophages demonstrated that the esters were non-toxic. Concluding, eight alkyl 3,5-dinitrobenzoate 2e (C7) to 2l (C14) and four alkyl 4-nitrobenzoates 1g (C9) to 1i (C11) and 1k (C13) were stable in human plasma, actives (higher activity than respective acids) and non-toxic, demonstrating that these esters are viable candidates for antituberculosis prodrugs