Praktikable Methoden zur Dickenmessung histologischer Kunststoffschnittpräparate in quantitativ-stereologischen Analysen mit der physikalischen Disektormethode

Die Kenntnis der tatsächlichen Dicken histologischer Schnittpräparate ist für bestimmte quantitativ-stereologische Analysemethoden essentiell, wie beispielsweise für die Bestimmung von Zellzahlen mit dem physikalischen Disektorverfahren. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Methoden zur Messung der Dicke von dünnen (0,5 bis 3 μm) histologischen Schnittpräparaten von in verbreitet verwendeten Kunststoffmedien (GMA/MMA und Epon) eingebetteten Gewebeproben etabliert und bewertet. Eine herkömmliche Methode zur Bestimmung der Dicke eines Kunststoffschnittes besteht darin, den Schnitt orthogonal zu seiner Schnittebene erneut in Kunststoff einzubetten und die Dicke des Vertikalschnittes des wiedereingebetteten Schnittes zu messen. Dieses Verfahren der orthogonale Wiedereinbettung (OWE) ist jedoch sehr arbeits- und zeitaufwendig, insbesondere bei der Erstellung von transmissions-elektronenmikroskopischen OWE-Schnittpräparaten. Zusätzlich hängt die Richtigkeit des Messergebnisses bei der OWE- Schnittdickenmessung davon ab, ob der wiedereingebettete Schnitt tatsächlich orthogonal, oder (versehentlich) schräg eingebettet bzw. geschnitten wird. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit eine Variante der OWE-Methode entwickelt, mit der das Ausmaß einer unbeabsichtigten Schiefeinbettung des wiedereingebetteten Schnittes bestimmt und entsprechend korrigiert werden kann. Hierzu wird der wiedereinzubettende Schnitt (OWE-Schnitt) plan auf eine Kalibrierungsfolie bekannter Dicke verbracht und zusammen mit dieser (orthogonal) in Epon eingebettet und geschnitten. Die tatsächliche Dicke des Epon-OWE-Schnittes und der tatsächliche Wiedereinbettungswinkel des „OWE-Schnitt-Kalibrierungsfolien-Sandwichs“ kann dann aus den gemessenen Dicken der Vertikalschnitte der Kalibrierungsfolie und des OWE-Schnittes, sowie der bekannten tatsächlichen Dicke der Kalibrierungsfolie errechnet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden mit dieser Methode die Dicken von mehr als 20 orthogonal wiedereingebetteten GMA/MMA- und Epon-Schnitten mit Licht- und elektronenmikroskopischen Messungen bestimmt. Bei Verwendung von Flach-einbettungsformen betrug die durchschnittliche Abweichung des tatsächlichen Einbettungswinkels von der orthogonalen Schnittebene (bei über 100 Epon-OWE- Schnitten) lediglich zwischen 3 ̊ und 15 ̊ (10 ±2 ̊), entsprechend einer Abweichung der gemessenen von der tatsächlichen Schnittdicke von 0,2% bis 3,7% (2 ±2%). Als einfache und zügige Alternative zur OWE-Schnittdickenmessung histologischer Kunststoffschnittpräparate wurde ein auf dem physikalischen Prinzip der spektralen Reflektometrie (SR) beruhendes, kontaktfreies Verfahren zur Dünnschicht- dickenmessung getestet. Mit kommerziell erwerbbaren Spektralreflektometern kann die Dicke von (lichtdurchlässigen) Dünnschichten von Materialien mit bekannten Lichtbrechungsindices bei Durchleuchtung mit Licht definierter Wellenlängenbereiche und Einfallswinkeln durch Messung der an der/den Ober- und Unterseite(n) der Schicht(en) auftretenden Lichtreflexion(en) bestimmt werden. Die Messbereiche erstrecken sich hierbei, abhängig vom untersuchten Material, von wenigen Nanometern bis zu einigen hundert Mikrometren. SR-Geräte werden beispielsweise zur Messung der Dicke von industriell gefertigten Lackschichten, Platinenleitungsbahnen, oder Oberflächenbeschichtungen optischer Linsen und medizinischer Implantate verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein F20 Reflektometer der Firma Filmetrics® (San Diego, USA) benutzt, um die Schnittdicken von 150 (ungefärbten) GMA/MMA- und 35 Epon-Schnitten aus jeweils 5 Schnittserien mit nominellen Schnittdicken von 1 μm, 2 μm und 3 μm (GMA/MMA) bzw. 0,5 μm (Epon) zu messen, die von unterschiedlich lange gelagerten (Nierengewebe-)Blöcken (Archivmaterial von 2005-2016) angefertigt wurden. Nach Festlegung geeigneter Geräteeinstellungen wurde die Dicke jedes einzelnen Schnittes an 4-6 unterschiedlichen (gewebefreien) Lokalisationen gemessen (insgesamt über 100 Einzelmessungen). Die Werte der innerhalb individueller Schnitte gemessenen Schnittdicken variierten nur minimal (0,06 ±0,05 μm bei GMA/MMA Schnitten und 0,007 ±0,008 μm bei Epon-Schnitten), genau wie die gemessenen Schnittdicken unterschiedlicher Schnitte einer Schnittserie (GMA/MMA: 6,0 ±2,9% und Epon: 3,7 ±1,0%). Durchschnittlich wichen die SR-Schnittdickenmesswerte bei GMA/MMA- und Epon-Schnitten um weniger als 1% von den Schnittdicken ab, die mittels OWE (mit Einbettungswinkelkorrektur) an denselben Schnitten ermittelt wurden. Diese Ergebnisse belegen die hervorragende Eignung des SR-Verfahrens zur berührungsfreien, effizienten Dickenmessung histologischer GMA/MMA- und Epon- Schnitte bei einem geringen Zeitaufwand von nur etwa einer Sekunde pro Messung. Neben Schnittdickenmessungen im Rahmen quantitativ-stereologischer Analysen kann das SR-Verfahren auch zur Überprüfung der nominellen Schnittdicken und der Wiederholungsgenauigkeit der Schnittdicken bei Mikrotomen eingesetzt werden.The accuracy of quantitative stereological analysis tools such as the physical disector method for estimation of e.g., cell numbers, substantially depends on the precise determination of the thickness of the analyzed histological sections. The present study established and evaluated different methods for the determination of the thickness of thin (0.5 to 3 μm) histological sections of tissue samples embedded in broadly applied plastic resins (glycol methacrylate/methyl methacrylate (GMA/MMA) and diglycidyl ether (Epon)). One conventional method for measurement of histological section thickness is to re-embed the section of interest (in plastic embedding medium) vertically to its original section plane. The section thickness is then measured in a subsequently prepared histological section of this orthogonally re-embedded sample. However, the orthogonal re-embedding (ORE) technique is quite work- and time- intensive, especially, if ultra-thin sections for transmission electron microscopic analyses are prepared. The accuracy of the ORE-technique additionally depends on the precision of the orthogonal embedding, since an unintentionally slightly oblique (non-orthogonal) positioning of the re-embedded sample-section will cause inaccurate section thickness measurement values. To address this problem, an improved variant of the conventional ORE-technique was developed in the present study, allowing for determination of the factual section plane angle of the re-embedded section, and correction of measured section thickness values for oblique (non-orthogonal) sectioning. For this, the analyzed section is mounted flat on a foil of known thickness (calibration foil) and this “ORE-section-calibration foil-stack” is then vertically (re)- embedded and sectioned. The factual thickness and the section angle of the re- embedded section is then calculated from the measured thickness of the re-embedded section and the deviation of the measured thickness of the calibration foil and its factual thickness, using basic geometry. Using this improved ORE-technique, the thicknesses of >20 orthogonally re-embedded GMA/MMA- and Epon-sections were determined by light- and transmission electron microscopic analysis. Using flat-embedding molds for orthogonal re-embedding of the ORE-section-calibration foil-stacks in Epon, the deviation of the actual embedding angle from an ideal orthogonal orientation ranged from only 3 ̊ to 15 ̊ (average: 10 ±2 ̊), referring to a deviation of the measured and the true section thicknesses of 0.2% to 3.7% (average: 2 ±2%). To find a practicable, fast, and accurate alternative to ORE, the present study also evaluated the suitability of spectral reflectance (SR) measurement for contact-free, direct determination of the thicknesses of histological plastic sections in thicknesses that are regularly applied in physical disector analyses. Using spectral reflectometers, the thicknesses of thin- layers (films) of (light-permeable) materials with known refractive indices can be determined from the reflection of light that occurs at the top and bottom surfaces of the film when it is illuminated with light of defined wave length ranges in known angles of incidence. Depending on the examined material, the ranges of thickness measurements range from few nanometers to several hundred microns. Industrial applications of SR e.g., comprise thickness measurements of measure the thicknesses of varnish layers, metallic layers on circuit boards, or coatings of optical lenses and medical implants. In the present study, a commercially available F20 reflectometer ® (Filmetrics , San Diego, USA) was used to measure the thicknesses of 150 unstained GMA/MMA sections with nominal section thicknesses of 1, 2, and 3 μm, as well as 35 unstained Epon sections of 0.5 μm nominal thickness. The examined sections were sampled from section series cut from each 5 GMA/MMA and Epon (kidney) tissue blocks that had been stored in the archive of the Institute of Veterinary Pathology for 1-10 years. Subsequent to the establishment of the appropriate instrumental settings of the reflectometer, section thicknesses were determined in 4-6 (tissue-free) measurement locations in each examined section (more than 1000 single measurements in total). The thickness measurements within individual sections did only display a minimal variability (0.06 ±0.05 μm in GMA/MMA sections and 0.007 ±0.008 μm in Epon-sections), as well as the measured section thicknesses of different sections taken from the same section series (GMA/MMA: 6.0 ±2.9% and Epon: 3.7 ±1.0%). Compared to the measured section thicknesses determined by ORE (with embedding-angle correction) in the same sections, SR measures displayed less than 1% deviation. These results show the applicability of SR to efficiently provide accurate, contact free histological plastic section thickness measurements as a prerequisite for reliable estimates of dependent quantitative stereological parameters. Of note, SR measurements of section thicknesses work peerlessly fast (less than one second per measurement). Additionally to section thickness measurements for quantitative stereological analyses, SR can also be applied to verify the nominal section thicknesses and the repetitive accuracy of microtomes