Desarrollo de un protocolo para la multiplicación masiva de Hyeronima alchorneoides por medio de embriogénesis somática

Proyecto de Graduación (Maestría en Ciencias Forestales) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Ingeniería Forestal, 2020Hyeronima alchorneoides es una especie forestal nativa de Costa Rica con madera de gran potencial industrial. Se caracteriza por presentar diversos problemas en su reproducción como baja viabilidad en las semillas y biología recalcitrante en el almacenamiento. Esto ha limitado la disponibilidad de material de siembra requerido para el establecimiento de plantaciones comerciales a mediana o gran escala. La propagación clonal in vitro es una biotecnología viable para este propósito y es una estrategia para aumentar el rendimiento de plantaciones comerciales al clonar masivamente en corto tiempo germoplasma élite. La embriogénesis somática es la metodología más promisoria para la propagación de árboles, debido a la posibilidad de producir semillas artificiales, almacenar y movilizar fácilmente el germoplasma y la oportunidad de manipulación genética. En el presente estudio se reporta la inducción de la embriogénesis somática indirecta en H. alchorneoides a partir de callos derivados de hojas. En el establecimiento se determinó que el tiempo en NaOCl fue un factor significativo en la asepsia y sobrevivencia de los explantes. El tipo de regulador en la inducción de callo embriogénico tuvo efectos significativos en las variables de respuesta, se produjeron callos al utilizar NAA, 2,4-D y picloram, encontrándose estructuras embriogénicas en 20% de los callos cultivados en picloram. En la etapa de proliferación se evaluó el efecto de tres concentraciones de picloram y tidiazuron en el subcultivo con respecto a las utilizadas en la inducción y se determinó que en presencia de tidiazuron un 45.2% de callos fueron embriogénicos y que el subcultivo en 100% o 50% de regulador en la proliferación permitió la mayor cantidad de callos embriogénicos que el medio sin reguladores en esta etapa. Se determinó que la línea de origen del callo no tuvo efecto significativo en la respuesta embriogénica. Tanto con el estereoscopio como con el microscopio electrónico de barrido se identificaron embriones somáticos en estadios de torpedo y globular. El presente es el primer reporte de inducción de embriogénesis somática en una especie de la familia Phyllanthaceae usando picloram y tidiazuron. La metodología descrita se proyecta como una base para la optimización de la propagación clonal masiva, la manipulación genética y el almacenamiento a largo plazo de la especie.Hyeronima alchorneoides is a native forestry species from Costa Rica. Its wood has shown an outstanding potential for industrial uses. Moreover, this species presents several reproductive problems such as low seed viability and recalcitrant storage behavior. Those problems have caused a limited availability of the required planting material for establishment of commercial plantations. In vitro clonal propagation is a viable and cost-effective biotechnology for this aim, and a strategy to increase the yield of the commercial plantations, because of the possibility of massive cloning the germplasm quickly. Somatic embryogenesis is considered one the most promising methodologies for trees propagation. Somatic embryos could be used to produce artificial seeds, and those seeds could be stored and transported with ease. In addition, working with somatic calluses makes more feasible genetic manipulation and non-conventional biotechnological approaches for breeding. Presently, we report an indirect somatic embryogenesis method for the propagation of H. alchorneoides, using foliar segments for calluses induction. Initially, surface sterilization of explants was evaluated by incubating them in different concentrations of NaOCl and H2O2 for several periods, and it was determined that incubation time in NaOCl was the only significant factor in the survival and aseptic number of explants. Afterwards, in the induction of calluses was determined that the plant growth regulator caused significant effects in the response variables. It was possible to produce calluses with NAA, 2,4-D and picloram, moreover, embryogenic structures were only identified in 20% of the cultures with picloram. In the proliferation stage, we evaluated the effect of three concentrations of picloram and three concentrations of thidiazuron in the subculture medium with respect to the ones used in the induction. Here we determined that 45.2% of cultures with thidiazuron showed embryogenic structures, and calluses subcultured in presence of 100% or 50% during the proliferation stage made possible the production of more embryogenic calluses compared to the subculture in a medium free of growth regulators. Additionally, it was determined that the genetic origin of the calluses (line) did not caused significant effects in the response variables. Using both the stereo microscope and the scanning electron microscope, we observed somatic embryos in torpedo and globular stages. The present report described the first methodology for somatic embryogenesis in a species of the Phyllantaceae family using thidiazuron and picloram, and is expected to support the clonal propagation, genetic manipulation and cryopreservation of H. alchorneoides