Protection against paracetamol-induced adverse effects in the liver by the inhibition of the protein tyrosine phosphatase 1B

Tesis Doctoral presentada por Maysa Ahmed Abd El-Hamid Mobasher en el Departamento de Bioquímica de la Universidad Autónoma de Madrid para optar al grado de Doctor, y realizada en el Instituto de Investigaciones Biomédicas "Alberto Sols" (CSIC-IIBM).[EN]: Acute hepatic failure secondary to acetaminophen (APAP) poisoning is associated with high mortality. PTP1B is a negative regulator of tyrosine kinase growth factor signaling. In the liver, this pathway confers protection against injury. However, the involvement of PTP1B in the intracellular networks activated by APAP is unknown. We have assessed PTP1B expression in APAP-induced liver failure in humans and its role in the molecular mechanisms that regulate the balance between cell death and survival in human and mouse hepatocytes as well as in a mouse model of APAP-induced hepatotoxicity. PTP1B expression was increased in human liver tissue removed during liver transplant from patients for APAP overdose. PTP1B was up-regulated by APAP in primary human and mouse hepatocytes together with activation of JNK and p38 MAPK, resulting in cell death. Conversely, Akt phosphorylation and the anti-apoptotic Bcl2 family members BclxL and Mcl1 were decreased. PTP1B deficiency in mouse hepatocytes protected against APAP-induced cell death preventing GSH depletion, ROS generation and activation of JNK and p38 MAPK. APAP-treated PTP1B-/- hepatocytes showed enhanced anti-oxidant defense through the glycogen synthase kinase GSK3β/SKF axis, delaying tyrosine phosphorylation of Nrf2 and its nuclear exclusion, ubiquitination and degradation. IGFIR-mediated signaling decreased in APAP-treated wild-type hepatocytes, but was maintained in PTP1B-/- cells or in wild-type hepatocytes with reduced PTP1B levels by RNA interference. Likewise, both signaling cascades were modulated in mice resulting in less severe APAP hepatotoxicity in PTP1B-/- mice. Our results demonstrated that PTP1B is a central player of the mechanisms triggered by APAP in hepatotoxicity suggesting a novel therapeutic target against APAPinduced liver failure.In the initial experiments of APAP-mediated toxicity in hepatocytes we found that APAP also increased PTP1B and activated JNK at subtoxic doses. These data prompted us to evaluate the cross-talk between subtoxic doses of APAP and insulin signaling in hepatocytes. Insulin signaling was decreased in hepatocytes stimulated with subtoxic doses of APAP through decreasing IR and IRS1 tyrosine phosphorylation. However, PTP1B deficiency protected against these effects. In an in vivo chronic treatment with APAP, wild-type mice showed a trend towards a decrease in whole body glucose homeostasis whereas in mice lacking PTP1B no deleterious effects were observed.[ES]: El fallo hepático agudo debido a una sobredosis de paracetamol está asociado con una elevada mortalidad. La PTP1B modula negativamente la señalización mediada por los receptores de factores de crecimiento de la súper familia tirosina quinasa. En el hígado, estas rutas confieren protección frente al daño. En esta Tesis Doctoral hemos investigado la expresión de PTP1B en el daño agudo inducido por sobredosis de paracetamol en humanos, así como su papel en la regulación de los mecanismos moleculares responsables del balance supervivencia/muerte celular en el hígado. Hemos encontrado un aumento en la expresión de PTP1B en el tejido hepático procedente de individuos que necesitaron trasplante tras una sobredosis de paracetamol. Así mismo, los niveles de PTP1B aumentaron en hepatocitos humanos y murinos tratados con paracetamol en paralelo con la activación de las quinasas de estrés JNK y P38 MAPK y la inducción de muerte celular. Por el contrario, la activación de Akt y los niveles de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl2 se encontraron disminuidos. La deficiencia en PTP1B protegía a los hepatocitos frente a la muerte inducida por paracetamol ya que preveía la depleción de GSH, la generación de ROS y la activación de las quinasas de estrés. Además, los hepatocitos PTP1B-/- tratados con APAP presentaron una mayor respuesta antioxidante modulando las quinasas GSK3β/SKF lo que retrasaba la fosforilación en tirosina del Nrf2 responsable de su salida del núcleo y posterior ubiquitinación y degradación. La inhibición de PTP1B también evitaba la disminución de la fosforilación del IGF-IR y Akt. Estos dos mecanismos se modulaban de igual manera en ratones sometidos a una sobredosis de paracetamol, presentando los ratones PTP1B-/- una menor hepatotoxicidad. Estos resultados demostraban que la PTP1B regula los mecanismos moleculares desencadenados por dosis tóxicas paracetamol, lo que sugiere que la PTP1B podría ser una diana terapéutica frente a este daño hepatocelular. La expresión de PTP1B y la activación de las quinasas de estrés también aumentaban en hepatocitos estimulados con dosis subtóxicas de paracetamol, de manera similar a lo que ocurre en situaciones de resistencia a la insulina. Hemos encontrado que dosis subtóxicas de paracetamol disminuyen la señalización de la insulina en los hepatocitos y este efecto se atenúa en ausencia de PTP1B. Por último, presentamos evidencias de que la administración crónica de paracetamol podría alterar la homeostasis glucídica del organismo y esto se evitaría mediante la inhibición de la PTP1B.This work has been founded by a predoctoral fellowship of the JAE program (CSIC). The experimental research was founded by projects SAF2009-01615 and SAF2012-33283 (to AMV) from MINECO.Peer Reviewe