Development of efficient eukaryotic and bacterial expression systems for functional studies of recombinant proteins of biomedical interest

Al llarg aquesta tesi s’han fet molts esforços per desenvolupar un sistema d’expressió heteròloga de glicoproteïnes humanes d’alt rendiment, puresa i homogeneïtat, així amb la flexibilitat necessària per modificar la proteïna a voluntat. Hem desenvolupat dos sistemes d’expressió a eucariotes, uno a cèllules de Drosophila Schneider 2, per a l’expressió inductible mitjançant l’addició de Cu2SO4 i per a l’expressió transitòria amb transfecció de polietilenimina (PEI); i un per a mamífer, un sistema d’expressió transitòria basat en cèl·lules Expi293F i transfecció de PEI. La proteòlisi és una part fonamental de la rotació de proteïnes en organismes vius i el seu desequilibri pot comportar malalties, provocant inflamacions, malalties neurodegeneratives, càncer o mort cel·lular entre altres trastorns. Per tant, els mecanismes que regulen l’activitat de la peptidasa s’han de regular de manera estricta per garantir l’activitat proteolítica adequada en el moment i lloc adequats. La queilis-isozima 1 de la subtilisina humana (hSKI1) és la proteïna serina que catalitza el primer pas a l’activació proteolítica de les proteïnes d’unió de l’element regulador d’esterol (SREBPs), regulador clau del metabolisme dels lípids intracel·lulars. Aquesta proteasa és una proteïna transmembrana localitzada al reticle endoplasmàtic i l’aparell de Golgi i la seva maduració és un procés molt complex. Vam aconseguir una expressió soluble als sistemes d’expressió d’insectes i mamífers i establim les bases per a futurs estudis bioquímics i estructurals amb garanties d’èxit. Al segon projecte, el principal inhibidor de la proteasa del plasma (la α2-macroglobulina humana, hα2M), que neutralitza un ampli espectre d’endopeptidases, però també modula l’activitat de les citocines, hormones, factors de creixement i altres proteïnes i, per tant, per tant té un gran impacte en la fisiologia humana. Es van realitzar assajos bioquímics, biofísics, estructurals i d’unió amb altres dianes interessants (Streptococcus GRAB, TGFβ2 humà i LRP1 humà) en complexos amb hα2M autèntics i recombinants per a caracteritzar aquestes interaccions. Per tant, també vam expressar les variants hα2M en cèl·lules eucariotes i vam purificar l’autèntica proteïna de la sang. A més, expressem pro-TGFβ2 a cèllules d’insecte i mamífer i cristalizamos la forma madura de TGFβ2. I finalment, vam revisar la literatura disponible sobre la família de les metaloproteinases de matriu (MMP) fora de vertebrats i vam realitzar cerques a la base de dades de dominis catalítics de MMP potencials en invertebrats, plantes, fongs, virus, protistes, arqueus i bacteris. En general, la present tesi ha establert nous i prometedors sistemes d’expressió al laboratori, que han beneficiat i ha contribuït substancialment al camp als nivells d’expressió, purificació i cristal·lització de la proteïna serina hSKI1 i l’inhibidor de la proteasa hα2M, sols o interactuant amb GRAB i TGFβ2.En esta tesis, se han realizado esfuerzos para desarrollar un sistema para la expresión heteróloga de glicoproteínas humanas con alto rendimiento, pureza y homogeneidad, así como la flexibilidad necesaria para diseñar la proteína a voluntad. Desarrollamos dos sistemas de expresión eucariotas, uno en células de Drosophila Schneider 2, (expresión inducible mediante la adición de Cu2SO4 y expresión transitoria con transfección con polietilenimina (PEI)); y otro en células de mamífero, (un sistema de expresión transitoria basado en células Expi293F y transfección con PEI). La proteólisis es una parte fundamental del recambio proteico en los organismos vivos y su desequilibrio puede conducir enfermedades, causando inflamación, enfermedades neurodegenerativas, cáncer o muerte celular, entre otros trastornos. Por lo tanto, los mecanismos que regulan la actividad de peptidasas deben estar exquisitamente regulados para garantizar una actividad proteolítica adecuada en el momento y lugar correctos. La subtilisina kexina-isozima 1 humana (hSKI1) es la serina proteasa que cataliza el primer paso en la activación proteolítica de las proteínas de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP), regulador clave del metabolismo de los lípidos intracelulares. Esta proteasa es una proteína transmembrana localizada en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi y su maduración es un proceso muy complejo. Logramos una expresión soluble en los sistemas de expresión de insecto y mamífero y sentamos las bases para futuros estudios bioquímicos y estructurales. En el segundo proyecto, se ha estudiado el principal inhibidor de proteasas del plasma (la α2-macroglobulina humana, hα2M), que tiene un gran impacto en la fisiología humana ya que neutraliza un amplio espectro de endopeptidasas, pero también modula la actividad de las citocinas, hormonas, factores de crecimiento y otras proteínas. Se realizaron ensayos bioquímicos, biofísicos, estructurales y de unión con otras proteínas interesantes (G-related α2-macroglobulin binding protein de Streptococcus pyogenes; human transforming growth factor-β2, TGFβ2; and human lipoprotein receptor-related protein 1, LRP1) en complejo con endógena y recombinante hα2Ms para caracterizar estas interacciones. Por lo tanto, también expresamos las variantes hα2M en células eucariotas y purificamos la proteína endógena de sangre. Además, expresamos pro-TGFβ2 en células de insecto y mamífero y cristalizamos la forma madura de TGFβ2. Y finalmente, revisamos la literatura disponible sobre la familia de metaloproteinasas de matriz (MMP) fuera de los vertebrados y realizamos búsquedas en la base de datos para potenciales dominios catalíticos de MMP en invertebrados, plantas, hongos, virus, protistas, arqueas y bacterias. En general, la presente tesis ha establecido nuevos y prometedores sistemas de expresión en el laboratorio y ha contribuido sustancialmente al campo en los niveles de expresión, purificación y cristalización en la serina proteasa hSKI1 y el inhibidor de proteasas de la sangre hα2M, solo o interactuando con GRAB y TGFβ2.In this thesis, efforts have been made to develop a system for heterologous expression of human glycoproteins with high yield, purity and homogeneity, as well as the necessary flexibility to engineer the protein at will. We established two eukaryotic expression systems, based in Drosophila Schneider 2 cells (inducible expression of stable cell lines by addition of Cu2SO4 and transient expression with polyethylenimine (PEI) transfection) and in mammalian cells (transient expression on Expi293F cells with PEI transfection). Proteolysis is a fundamental part of the protein turnover in living organisms and its imbalance may lead to diseases, causing inflammation, neurodegenerative diseases, cancer or cell death among other disorders. Thus, mechanisms that regulate peptidase activity must be exquisitely regulated to ensure proper proteolytic activity at the right time and place. The human subtilisin kexin-isozyme 1 (hSKI1) is the serine protease which catalyzes the first step in the proteolytic activation of the sterol regulatory element binding proteins (SREBPs), key regulator of the intracellular lipid metabolism. This protease is a transmembrane protein localized in endoplasmic reticulum and Golgi apparatus and its maturation is a very complex process. We achieved to express it soluble in the insect and mammalian expression systems and laid the foundations for future biochemical and structural studies. In the second project, the main protease inhibitor of the plasma blood has been studied (the human α2-macroglobulin, hα2M), which has great impact on human physiology by participating in inhibition of a broad spectrum of endopeptidases, but also by modulating the activity of cytokines, hormones, growth factors and other proteins. Biochemical, biophysical, structural and binding assays with other interesting targets (G-related α2-macroglobulin binding protein from Streptococcus pyogenes, GRAB; human transforming growth factor-β2, TGFβ2; and human lipoprotein receptor-related protein 1, LRP1) in complex with wild-type and recombinant hα2Ms were performed to characterize these interactions. Therefore, we expressed the hα2M variants in eukaryotic cells and purified the endogenous protein from blood. Furthermore, we achieved to express soluble pro-TGFβ2 in insect and mammalian cells and we managed to crystallize the mature part of this protein. And finally, we reviewed the available literature on the matrix metalloproteinase (MMP) family outside vertebrates and performed database searches for potential MMP catalytic domains in invertebrates, plants, fungi, viruses, protists, archaea and bacteria. Overall, the present thesis has established new and promising expression systems at the laboratory and has contributed substantially to the field at the expression, purification and crystallization levels on the serine protease hSKI1 and protease inhibitor hα2M, alone or interacting with GRAB and TGFβ2