Estimulación de la síntesis de nucleótidos como tratamiento de los defectos en la replicación del ADN mitocondrial

La síndrome de depleció i delecions múltiples de l’ ADN mitocondrial (ADNmt) (SDDM) engloba un grup de malalties minoritàries d’ herència autosòmica, recessiva o dominant, degudes a alteracions en el manteniment de l’ ADNmt. Aquestes alteracions es manifesten com una pèrdua de molècules d’ ADNmt (depleció), acumulació de delecions múltiples o de mutacions puntuals a l’ ADNmt. L’ espectre clínic de la SDDM és molt ampli i heterogeni. Pot manifestar-se en un rang molt ampli de gravetat, des d’ afectacions simples i relativament lleus, fins a afectacions de progressió ràpida i\/o multiorgàniques que condueixen a la mort del pacient durant els primers anys de vida. Genèticament, la SDDM és també heterogènia i s’ associa a mutacions en gens nuclears els productes dels quals participen en processos relacionats d’ alguna forma amb el manteniment de l’ ADNmt. Un d’ aquests processos és l’ homeòstasi de dNTPs que resulta imprescindible per garantir una correcta replicació de l’ ADNmt. El present treball de tesi doctoral consta d’ estudis preclínics in vitro i in vivo per a l’ aplicació de l’ administració de desoxirribonucleòsids (dNs) com a precursors de la síntesi de dNTPs al tractament de dues formes de SDDM, la deficiència en timidina quinasa 2 (TK2) i en la subunitat catalítica de la polimerasa mitocondrial (POLG). La TK2 és la quinasa responsable de la primera i limitant fosforilació de desoxitimidina (dThd) i desoxicitidina (dCtd) al mitocondri, essencial per l’ obtenció de dTTP i dCTP. La deficiència en TK2 es presenta típicament com una miopatia greu i està associada a una marcada depleció de l’ ADNmt al múscul. Hem assajat l’ administració de dThd i dCtd a un model murí knock-out per la Tk2 (Tk2KO). Aquests ratolins desenvolupen una encefalomiopatia fatal que progressa ràpidament i condueix a la mort als 16 dies d’ edat. Amb el tractament, la supervivència dels ratolins Tk2KO augmenta a 34 dies, i els nivells d’ ADNmt a múscul es normalitzen. Tot i això, el tractament perd eficàcia amb l’ edat. Descrivim canvis importants al metabolisme de dNTPs que tenen lloc al llarg del desenvolupament normal del ratolí i contribueixen a reduir l’ eficàcia del tractament amb l’ edat. D’ altra banda, hem utilitzat fibroblasts derivats de pacients amb mutacions a la subunitat catalítica de la polimerasa-gamma (POLG), proteïna que s’ encarrega de la síntesi de l’ ADNmt. Mutacions en aquest enzim causen SDDM amb un ampli espectre clínic associat a depleció i delecions múltiples de l’ ADNmt. El tractament basat en dNs indueix un augment al contingut dels quatre dNTPs mitocondrials, i això és suficient per restituir la capacitat replicativa de l’ ADNmt sense alterar la seva fidelitat, a cèl·lules amb mutacions en diferents dominis funcionals de POLG. Els resultats obtinguts en aquest treball suggereixen que l’ estimulació de la síntesi de dNTPs a través de la suplementació amb dNs podria ser una estratègia terapèutica vàlida per SDDM diferents a la deficiència en TK2 o POLG, així como per altres malalties en les que un increment a la síntesi de l’ ADNmt pogués resultar beneficiós.El síndrome de depleción y deleciones múltiples del ADN mitocondrial (ADNmt) (SDDM) engloba un grupo de enfermedades minoritarias de herencia autosómica, recesiva o dominante, debidas a alteraciones en el mantenimiento del ADNmt. Estas alteraciones se manifiestan como una pérdida de moléculas de ADNmt (depleción), acumulación de deleciones múltiples o de mutaciones puntuales en el ADNmt. El espectro clínico del SDDM es muy amplio y heterogéneo. Puede manifestarse en un rango de gravedad muy distinto, desde afectaciones simples y relativamente leves, hasta afectaciones de progresión rápida y\/o multiorgánicas que conducen a la muerte del paciente durante sus primeros años de vida. Genéticamente el SDDM es también muy heterogéneo y se asocia a mutaciones en genes nucleares cuyos productos intervienen en procesos relacionados de algún modo con el mantenimiento del mtDNA. Uno de estos procesos es la homeostasis de dNTPs que resulta imprescindible para garantizar una correcta replicación del ADNmt. El presente trabajo de tesis doctoral consta de estudios preclínicos in vitro e in vivo para la aplicación de la administración de desoxirribonucleósidos (dNs) como precursores de la síntesis de dNTPs en el tratamiento de dos formas de SDDM, la deficiencia en timidina quinasa 2 (TK2) y en la subunidad catalítica de la polimerasa mitocondrial (POLG). La TK2 es la quinasa responsable de la primera y limitante fosforilación de desoxitimidina (dThd) y desoxicitidina (dCtd) en mitocondria, esencial en la obtención de dTTP y dCTP. La deficiencia en TK2 se presenta típicamente como una miopatía grave que está asociada a una marcada depleción del ADNmt en músculo. Hemos ensayado la administración de dThd y dCtd en un modelo murino knock-out para Tk2 (Tk2KO). Estos ratones desarrollan una encefalomiopatía fatal que progresa rápidamente y conduce a la muerte a los 16 días de edad. Con el tratamiento la supervivencia de los ratones Tk2KO asciende a 34 días, y los niveles de ADNmt en músculo se normalizan. A pesar de ello, el tratamiento pierde efecto con la edad. Describimos cambios importantes en el metabolismo de dNTPs que tienen lugar durante el desarrollo normal del ratón y contribuyen a reducir la eficacia del tratamiento con la edad. Por otro lado, hemos trabajado con fibroblastos derivados de pacientes con mutaciones en la subunidad catalítica de la polimerasa-gamma (POLG), proteína que se encarga de la síntesis del ADNmt. Mutaciones en esta enzima causan SDDM con un amplio espectro clínico asociado a depleción y deleciones múltiples del ADNmt. El tratamiento basado en dNs induce un aumento en el contenido de los cuatro dNTPs mitocondriales, y esto es suficiente para restituir la capacidad replicativa del ADNmt sin alterar su fidelidad, en células con mutaciones en diferentes dominios funcionales de POLG. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la estimulación de la síntesis de dNTPs a través de la suplementación con dNs podría ser una estrategia terapéutica válida para SDDM distintos a la deficiencia en TK2 o POLG, así como para otras enfermedades en las que un incremento en la síntesis del ADNmt pueda resultar beneficioso.The mitochondrial DNA depletion and multiple deletions syndrome (mtDNA) (MDDS) comprises a group of rare diseases of autosomal recessive or dominant inheritance, due to alterations in the maintenance of mtDNA. These alterations manifest as a loss of mtDNA molecules (depletion), accumulation of multiple deletions or point mutations in the mtDNA. The clinical spectrum of MDDS is very broad and heterogeneous. It can manifest in a wide range of phenotypes with different severity, from simple and relatively mild affectations to rapidly progressing and\/or multiorgan diseases that lead to early death of the patient during his first years of life. Genetically, the MDDS is also very heterogeneous, being associated with mutations in nuclear genes whose products are somehow involved in processes related with mtDNA maintenance. One of these processes is dNTP homeostasis, which is essential to sustain a correct replication of mtDNA. This doctoral thesis work consists of in vitro and in vivo preclinical studies on the administration of deoxyribonucleosides (dNs), precursors for the synthesis of dNTPs, as a therapy for treating two forms of MDDS, the deficiencies in thymidine kinase 2 (TK2) and in the catalytic subunit of mitochondrial polymerase (POLG). TK2 is the kinase responsible for the first and limiting phosphorylation of deoxythymidine (dThd) and deoxycytidine (dCtd) in mitochondria, which is essential to obtain dTTP and dCTP. TK2 deficiency usually presents as a severe myopathy associated with a marked depletion of mtDNA in muscle. We have tested the administration of dThd and dCtd in a murine knock-out model for Tk2 (Tk2KO). These mice develop a fatal encephalomyopathy that progresses rapidly leading to death at 16 days of age. With the treatment, survival of Tk2KO mice is extended to 34 days, and the levels of mtDNA in muscle are normalized. However, the therapeutic effect is lost with aging. Here, we describe important changes in dNTP metabolism occurring during normal mouse development and reducing the effectiveness of the treatment with aging. On the other hand, we have worked with fibroblasts derived from patients with mutations in the catalytic subunit of polymerase-gamma (POLG), a protein responsible for mtDNA synthesis. Mutations in this enzyme cause SDDM with a broad clinical spectrum associated with depletion and multiple deletions of mtDNA. The dNs-based treatment induces an increase in the content of the four mitochondrial dNTPs, and this is sufficient to restore the mtDNA replicative capacity while preserving its fidelity, in cells with mutations affecting the different functional domains of POLG. The results obtained in this work suggest that stimulating the dNTP synthesis through dNs supplementation could be a valid therapeutic strategy for MDDS other than TK2 or POLG deficiency, as well as for other diseases in which an increase in mtDNA replication may result beneficial