Evaluation of the significance of molecular methods in the diagnosis of invasive fungal infections: Comparison with conventional methods

Özellikle riskli hasta gruplarında gerçek ya da fırsatçı patojen mantarların neden olduğu enfeksiyonların tanısında direkt mikroskobik inceleme ve kültür, halen değerini koruyan standart konvansiyonel yöntemlerdir. Bu yöntemlerin uygulama ve değerlendirmelerinde karşılaşılan bazı sorunlar nedeniyle, günümüzde daha hızlı, kolay uygulanabilir, yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip yeni tanı yöntemlerine gereksinim duyulmaktadır. Bu çalışmada, klinik örneklerde etken olan mantarların tespiti ve tanımlanmasında moleküler yöntemler ile alınan sonuçların, eş zamanlı olarak uygulanan konvansiyonel tanı yöntemleri ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya, immünsüpresif 50 hastaya ait klinik örnekler [24 bronkoalveoler lavaj (BAL); 14 kan; beş periton, dört plevra ve bir perikard sıvısı; bir beyin omurilik sıvısı (BOS), bir idrar] dahil edilmiştir. Tüm örnekler sabouraud dekstroz ve beyin kalp infüzyon agar besiyerlerine ekilerek 25-30°C ve 37°C’de 30 gün boyunca inkübe edilmiş; kan dışındaki örnekler ise %10-15 KOH + kalkoflor beyazı ile boyanarak direkt mikroskopi ile incelenmiştir. İzolatların konvansiyonel olarak tanımlanmasında temel morfolojik ve biyokimyasal özellikler esas alınmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için örneklerden mantar DNA’sının saflaştırılmasında, hem fenol-kloroform-izoamil alkol (9-10 saat süreli) hem de ticari DNA ekstraksiyon kiti (6-7 saat süreli) kullanılmıştır. PCR yöntemi, mantarların ITS1, ITS2, ITS3, ITS4, 5.8S rDNA ve 28S rDNA bölgelerinden seçilen genel ve türe özgül primerler (multipleks) kullanılarak uygulanmıştır. Genel primerler ile 550 baz çifti (bp) büyüklüğünde mantarlara özgül bantlar; türe özgül primerler ile de 273 bp’de Candida albicans, 320 bp’de Candida parapsilosis, 423 bp’de Candida glabrata, 357 bp’de Candida tropicalis, 385 bp’de Aspergillus fumigatus ve 136 bp’de Cryptococcus neoformans’a özgül bantlar değerlendirilmiştir. Çalışılan 50 örneğin 17 (%34)’sinin kültüründe üreme saptanmış (12 BAL, üç kan ve bir idrar örneğinde C.albicans, bir kan örneğinde C.parapsilosis), kan dışı 36 örneğin 7 (%19.4)’si direkt mikroskopi ile pozitif bulunmuş (tümü BAL örneği) ve 27 (%54) örnek PCR ile olumlu sonuç vermiştir. Kültürlerinde üreme olan 17 örneğin tümünde PCR ile de pozitif sonuç alınmış, kültürü negatif 23 örnek ise PCR ile de negatif bulunmuştur. Direkt misroskopi ve kültürü negatif bulunan beş BAL, dört periton sıvısı ve bir BOS olmak üzere toplam 10 örnekte PCR ile mantar DNA’ları saptanmış ve multipleks PCR ile bunların sekizi C.albicans, biri C.parapsilosis (periton sıvısı örneği) ve biri de C.neoformans (BOS örneği) olarak tanımlanmıştır. PCR negatif, kültür pozitif bir sonuç elde edilmemiştir. Kültür negatif, PCR pozitif bulunan bu 10 örneğin antifungal tedavi alan hastalara ait olduğu izlenmiş, kriptokokoz şüpheli bir hastanın BOS örneğinde sadece PCR ile C.neoformans DNA’sının saptanması, bu olguda hızla uygun tedaviye başlanmasına olanak sağlamıştır. İstatistiksel değerlendirmede, kültür ile PCR arasındaki uyum önemli düzeyde (k= 0.61; p< 0.001), mikroskopi ile PCR arasındaki uyum ise minimal düzeyde (k= 0.24; p< 0.001) saptanmış; kültür referans yöntem olarak alındığında, PCR yönteminin duyarlılığı %100, özgüllüğü ise %69.7 olarak belirlenmiştir. Çalışmamızda, kültürde üretilen ve konvansiyonel yöntemlerle tanımlanan tüm mantar türlerinin, uygulanan multipleks PCR ile de aynı şekilde tanımlandığı gözlenmiştir. Sonuç olarak, konvansiyonel yöntemler göz ardı edilmeksizin, hastanın klinik durumu ve laboratuvar koşulları dikkate alınarak, invazif mantar enfeksiyonlarının tanısında duyarlılığı yüksek bulunan PCR temelli testlerin kullanılmasının uygun olacağı düşünülmüştür.Direct microscopy and culture methods are still valuable standard conventional methods for the diagnosis of infections caused by true or opportunistic fungal pathogens, especially in high risk patients. However, some of the problems concerning the application and interpretation of those methods, indicate a need for more rapid, practical and reliable tests with high sensitivity and specificity. This study was conducted to compare the results obtained by molecular methods with the results of conventional methods performed simultaneously for the detection and identification of causative fungi in clinical samples. Clinical samples [24 bronchoalveolar lavage (BAL); 14 blood; 5 peritoneal, 4 pleural and 1 pericardial fluids; 1 cerebrospinal fluid (CSF), 1 urine] from 50 immunosuppressed patients were included in the study. All of the samples were cultivated on Sabouraud dextrose and brain-heart infusion agar media and incubated at 30&deg;C and 37&deg;C for 30 days. Samples other than blood were stained with 10-15% KOH + calcofluor white and examined by direct microscopy. Conventional identification of the isolates were performed by using basic morphological and biochemical characteristics. The isolation of fungal DNAs for polymerase chain reaction (PCR) was achieved by classical phenol-chloroform-isoamylalcohol procedure (9-10 hours) and commercial DNA extraction kit (6-7 hours) and general and species-specific primers (multiplex) from ITS1, ITS2, ITS3, ITS4, 5.8S rDNA and 28S rDNA regions were choosen for amplification. In PCR results, 550 base-paired (bp) bands obtained with universal primers were evaluated as fungal DNA positivity, and 273 bp, 320 bp, 423 bp, 357 bp, 136 bp and 385 bp bands with species-specific primers were evaluated as Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatus positivities, respectively. Seventeen (34%) of the 50 samples yielded fungal growth on culture (C.albicans in 12 BAL, 3 blood, 1 urine sample, and C.parapsilosis in 1 urine), while seven BAL out of 36 (19.4%) non-blood samples gave positive result by direct microscopy. Of the samples 27 (54%) were found positive by PCR. All of the 17 culture positive samples were also found PCR positive, and all of the 23 culture negative samples were also found PCR negative. However, fungal DNAs were detected by PCR in 10 of the samples (5 BAL, 4 peritoneal fluids, 1 CSF) which were negative by direct microscopy and culture methods. These fungi were identified as C.albicans (n= 8), C.parapsilosis (n= 1, from peritonal fluid) and C.neoformans (n= 1, from CSF) by multiplex PCR. No samples yielded PCR negative, culture positive result. All of those 10 PCR positive, culture negative samples belonged to patients who were under antifungal treatment. The detection of C.neoformans DNA from CSF sample of a patient with suspected cryptococcosis only with PCR provided the chance for rapid therapy. In statistical evaluation, the concordance between culture and PCR methods were found significantly high (k= 0.61; p&lt; 0.001), whereas it was minimal (k= 0.24; p&lt; 0.001) between direct microscopy and PCR. When considering culture as the reference method, the sensitivity and specificity of PCR were estimated as 100% and 69.7%, respectively. In addition, multiplex PCR was as successful as culture and conventional identification methods in the identification of all fungal species. As a result, without disregarding conventional methods, use of PCR might be recommended for the identification of fungal species on the basis of clinical status of the patient and conditions of the laboratory