Etablering av PCR-analys för verifiering av Treponema pallidum

Syfilis är en sexuellt överförbar infektion som orsakas av spiroketen Treponema pallidum subspecies pallidum. Laboratoriediagnostik utgörs i första hand av serologiska test tillsammans med kliniska fynd men på grund av olika faktorer är dessa inte helt pålitliga. Ett flertal olika PCR-metoder utvecklats som påvisar patogenen med hjälp av T-pallidum-specifika gener. En väl studerad gen med hög specificitet är polA-genen som anses vara en mycket robust och känslig metod och lämpar sig väl för att påvisa T. pallidum i kliniska material. Syftet med projektet är att utveckla och optimera en kvalitativ realtids-PCR i singelplex format för verifiering av T. pallidum, för diagnostisering av syfilis. I detta projekt har en realtids-PCR riktad mot polA för detektion av T. pallidum utvecklats. Metodens prestanda utvärderades med en kommersiellt framställd DNA-kontroll med avseende på sensitivitet, specificitet detektions-gräns. När samtliga moment verifierats och fastställts testades metoden på kliniskt material från sår. Den T. pallidum-specifika PCR-analysen visade att det inte förekom korsreaktivitet mot andra agens som förväntas finnas i sår från patient med misstänkt syfilis. Metoden uppvisade en känslighet vid spädning 1:100 (cirka 13 kopior/µl) och en precision på 36,3±0,8 Ct. Det kliniska provet visade på förekomst av T. pallidum dock är känsligheten något sämre än existerande referensmetod. Metoden kan användas i rutindiagnostik av T. pallidum dock bör utfallet från extraktion av DNA från sår studeras ytterligare för att eventuellt öka utbytet och detektera lägre koncentrationer i kliniskt material.Syphilis is a sexually transmitted infection caused by the spirochete Treponema pallidum subsp. pallidum. Laboratory diagnostics consist primarily of serological tests together with clinical findings for different reasons these methods are not reliable. A variety of PCR methods has been developed that target the pathogen using T. pallidum-specific genes. A well-studied gene with high specificity is the polA gene which is considered very robust and sensitive method and well suited for detection of T. pallidum in clinical materials. The aim of the project is to develop and optimize a qualitative real-time PCR in single-plex format for the verification of T. pallidum, for the diagnosis of syphilis. A real-time PCR targeting polA was developed for detection of T. pallidum. An evaluation of the method's performance was done with a commercially produced DNA control with regards to sensitivity, specificity detection limit and precision. When all test where verified and established, the method was tested on clinical material from ulcers. The results of the T. pallidum-specific PCR-assay showed that there was no cross-reactivity to other agents that are expected to be in ulcers from patients with suspected syphilis. The method showed a sensitivity at dilution 1:100 (about 13 copies/μl) and a precision of 36.3 ± 0.8 Ct.The clinical specimen showed presence of T. pallidum, however, the sensitivity was not as good than the existing reference method. The method can be used in routine diagnostics of T. pallidum, however, the outcome of extraction of DNA from ulcers should be further studied in order to increase the yield and detect lower concentrations in clinical material