Modeling of FUS- and C9ORF72-associated cortical neuropathology using patient-specific induced pluripotent stem cells

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Erkrankung, bei welcher speziell erste (kortikospinal) und zweite (spinal) Motorneurone (MN) von Neurodegeneration betroffen sind. Gegenwärtig bleibt ALS eine unheilbare Erkrankung. Der Tod tritt durchschnittlich 2 bis 5 Jahre nach Auftreten der Symptome ein. Circa 90% der Fälle treten sporadisch auf (sALS), während 10% familiär sind (fALS). Es ist von großem Interesse monogenetische Formen der fALS zu untersuchen um zugrundeliegende Pathologien und Mechanismen zu verstehen. Bislang wurden über 20 Gene mit ALS in Verbindung gebracht, einschließlich Fused in sarcoma (FUS) und Chromsosome 9 open reading frame (C9ORF72). Circa 4% der fALS Fälle sind durch dominante Mutationen in FUS verursacht und repräsentieren damit die dritthäufigste Form der fALS in Deutschland. Die G4C2 hexanucleotide repeat expansion (HRE) in C9ORF72 ist die häufigste Ursache für ALS und Frontotemporale Demenz (FTD). ALS Patienten unterscheiden sich erheblich in der Präsentation ihrer klinischen Symptome wie Ausbruchsort, Progressionsrate und Auftreten kognitiver Störungen. Diese Faktoren sind auch stark abhängig von der zugrundeliegenden Mutation in fALS. Ziel dieser Doktorarbeit ist die Modellierung von FUS- und C9ORF72-assozierter ALS in einem krankheits-relevanten in vitro Model von speziell kortikaler Neuropathologie mit Hilfe von Patienten-spezifischen iPSZs. Die Hypothese der vorliegenden Arbeit ist das in einer Zelltyp-abhängigen Art und Weise zugrundeliegende Erkrankungsmechanismen in kortikalen vs. spinalen Neuronen unterschiedlich betroffen sind. Humane iPSZ, generiert von gesunden Kontrollen und ALS Patienten mit FUS oder C9ORF72 Mutation, wurden für die gerichtete kortikale und spinale Differenzierung genutzt. Zusätzlich wurden zwei neue FUS-WT- und FUS-P525L-EGFP-markierte isogene Linien mittels CRISPR/Cas9n Technik generiert. Methoden basierend auf Immunfluoreszenz Färbungen und Lebendzell-Mikroskopie wurden angewendet um Krankheits-relevante Proteine, DNA Schäden und axonale Organell-Mobilität zu analysieren. In diesem Projekt konnte ein deutlicher Zelltyp-abhängiger Effekt auf analysierte Phänotypen beobachtet werden, während ALS-assoziierte Mutationen scheinbar nur geringfügige Effekte zeigten. Dementsprechend wurde ein Zelltyp-abhängiger Anstieg des basalen DNA Schadens in kortikalen Astrozyten vs. Neuronen und spinalen vs. kortikalen Neuronen detektiert. Jedoch konnte in FUS oder C9ORF72 mutierten kortikalen Zellen kein erhöhter DNA Schaden nachgewiesen werden, wie es zuvor in spinalen MN beobachtet wurde. Des Weiteren beeinflussen FUS Mutationen die Rekrutierung von FUS zu DNA-geschädigten Stellen, die Organell-Mobilität und die zytoplasmatische Fehllokalisation des Proteins in Abhängigkeit vom Zelltyp. In kortikalen Neuronen wurde in Bezug auf die Rekrutierung von mutiertem FUS und Organell-Mobilität nur leichte Mutations-abhängige und wesentlich schwächer ausgeprägte Effekte beobachtet als in spinalen MN. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Patienten-spezifische Zellmodelle ein wichtiges Instrument in der ALS Forschung sind und das vor allem Unterschiede zwischen kortikalen und spinalen MN weiter untersucht werden müssen, um zugrundeliegende Krankheits-relevante Mechanismen zu entschlüsseln und wie diese zum Fortschreiten der Erkrankung beitragenAmyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a of neurodegenerative diseases, in which neurodegeneration specifically affects upper (corticospinal) and lower (spinal) motor neurons (MNs). At present, ALS remains an incurable disease. Death occurs on average 2 to 5 years after symptom onset. About 90% are sporadic cases (sALS) and 10% are familial cases (fALS). It is of great interest to investigate monogenetic forms causing fALS to understand its underlying disease pathologies and mechanisms. Over 20 genes have been linked to ALS until now, including Fused in sarcoma (FUS) and Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72). About 4% of fALS cases are caused by dominant mutations within FUS, representing the third most common fALS form in Germany. The G4C2 hexanucleotide repeat expansion (HRE) in the C9ORF72 gene is the most common cause for ALS and Frontotemporal dementia (FTD). ALS patients differ significantly in their presentation of clinical symptoms, including site of onset, rate of progression, and presence of cognitive dysfunction. Those factors were also shown to highly depend on the underlying mutation in fALS cases. Aim of this thesis work is the modeling of FUS- and C9ORF72-associated ALS in a disease-related in vitro model of particularly cortical neuropathology using patient-derived iPSCs. The hypothesis of the current work is that underlying disease mechanisms do differentially affect cortical vs. spinal neurons and act in a cell type-dependent manner. Human iPSCs derived from healthy controls and ALS patients carrying mutations within FUS or C9ORF72 were used for directed cortical and spinal differentiation. Additionally, two new FUS-WT- and FUS-P525L-EGFP-tagged isogenic iPSC lines were generated by CRISPR/Cas9n gene editing. Immunofluorescence staining and live cell imaging approaches were implemented to analyze disease-associated proteins, DNA damage, and axonal trafficking. Within this project, a clear cell type-dependent effect on analyzed phenotypes was observed, while ALS-associated mutations seemed to have only minor effects. Accordingly, cell type-dependent increased basal DNA damage levels in cortical astrocytes vs. neurons and spinal vs. cortical neurons were detected. However, FUS or C9ORF72 mutant cortical cells do not recapitulate increased DNA damage levels as they have been observed in spinal MNs. Furthermore, FUS mutation affected recruitment to DNA damage sites, axonal trafficking, and cytoplasmic mislocalization differentially, depending on the analyzed cell type. In cortical neurons, recruitment and trafficking of mutant FUS showed only slight mutation-dependent effects and also less pronounced phenotypes than observed in spinal MNs. In conclusion, patient-specific cellular models are an important tool in ALS research and particularly differences between cortical and spinal MNs need to be further investigated to decipher underlying disease mechanisms, the interplay of cell types affected by the disease, and how they participate in disease progression