Etude des relations structure-fonction de la Glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase et Ingénierie métabolique de Clostridium acetobutylicum pour la production de Biohydrogène

La bactérie Clostridium acetobutylicum est l’un des meilleurs microorganismes producteurs d’hydrogène. Elle nécessite toutefois une amélioration de son rendement de conversion du glucose en hydrogène avant de pouvoir être utilisée dans un bioprocédé industriel économiquement viable. Il est possible de lever ce verrou métabolique en déviant une partie supplémentaire du flux électronique de la glycolyse vers la formation d’hydrogène par l’introduction dans le métabolisme central de la bactérie d’une Glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase (GAPOR), une tungsto-enzyme atypique issue d’archaea hyperthermophiles. \ud La création de cette nouvelle chaîne de transfert électronique implique l’interaction de trois protéines clés: la GAPOR; un transporteur d’électrons: la Ferrédoxine, et l’accepteur final responsable de la production d’hydrogène: l’Hydrogénase. Des améliorations significatives ont ainsi été apportées au système d’expression hétérologue de la GAPOR afin d’obtenir une enzyme stable et fonctionnelle. Le rôle essentiel de l’import du tungstène dans la cellule hôte a été souligné, ainsi que la synthèse et l’incorporation des différents cofacteurs dans la protéine. \ud La ferrédoxine étant l’intermédiaire de cette nouvelle chaîne, il est indispensable qu’elle soit capable d’interagir efficacement avec la GAPOR mais également avec l’hydrogénase à fer native de C. acetobutylicum. Une analyse comparative des activités de réduction de plusieurs ferrédoxines clostridiales et d’archaea par l’hydrogénase a permis de confirmer la flexibilité naturelle de cette enzyme vis-à-vis de ce type de partenaire redox et de mettre en évidence la ferrédoxine CAC0303 comme étant potentiellement le meilleur candidat dans le cadre de l’approche d’ingénierie métabolique envisagée. L’influence des différents facteurs biochimiques et biophysiques qui gouvernent le transfert électronique lors de l’interaction entre ces deux protéines a été étudié et a notamment fait l’objet d’une discussion approfondie.____________________________________________________________ Clostridium acetobutylicum is one of the most efficient reported micro-organism for hydrogen production. However, it requires the improvement of its hydrogen production yield from glucose before being used in an industrial bioprocess economically attractive. It is possible to remove this metabolic restriction by diverting an additional part electronic flow of glycolysis to the formation of hydrogen by the introduction in the central metabolism a 3-phosphate Glyceraldehyde oxidoreductase (GAPOR), an atypical tungsto-enzyme present in some hyperthermophilic archea.\ud The creation of this new electronic chain involves the interaction between three key proteins: a GAPOR, a specific electron carrier: Ferredoxin, and a Hydrogenase enzyme, the final electron acceptor and the catalyst of the hydrogen synthesis.\ud Significant improvements have been achieved to the heterologous system expression of GAPOR in order to obtain a stable and a functional enzyme. The essential contribution of tungsten import into the host cell, cofactors synthesis and incorporation into the protein was demonstrated.\ud The shuttle protein ferredoxin should be able to efficiently interact with both GAPOR and C. acetobutylicum hydrogenase. We have selected several ferredoxins naturally present in the in vivo surrounding of either GAPOR or hydrogenase, and compare their reduction rates by the C. acetobutylicum iron hydrogenase. Although the observed rates confirmed the natural substrate flexibility of iron hydrogenase, the ferredoxin CAC0303 was identified as a potential best partner than the others for the selected metabolic engineering strategy. The influence of different biochemical and biophysical factors that govern the electronic transfer between these two proteins has been particularly studied and discussed\ud \u