Estudio de la vía de señalización mediada por VHL y MAPKs en el carcinoma renal de células claras esporádico. Implicaciones clínicas pronósticas

El carcinoma de células renales (CCR) representa aproximadamente el 90% de las patologías renales malignas en adultos, siendo la variedad de células claras la más frecuente. Dentro de los factores genéticos que pueden afectar a este tipo de tumores destacan las alteraciones en el gen supresor tumoral VHL. Este gen codifica una proteína denominada VHL la cual desarrolla su función como supresor tumporal provocando la degradación de HIF-1a, factor de transcripción cuya misión es la transactivación de ciertos genes cuyo producto proteico aumenta la disponibilidad de oxígeno (VGEF, PDGF, EPO, etc.), o que están relacionados con la regulación del pH (CA-IX) cuando el oxígeno ambiental es limitado. En presencia de una actividad normal de VHL y con condiciones ambientales de oxígeno normales, HIF-1a se degrada y no ejerce su función. Sin embargo, en condiciones de hipoxia, VHL no ejerce su función ubiquitín ligasa, HIF-1a no es degradado y se activa la transcripción de sus genes diana. A su vez se ha descrito el hecho de que la proteína VHL controle tanto a HIF1-a como a ERK5, proteína perteneciente al grupo de las MAPK que se ha relacionado con vascularización y, a igual que las proteínas ERK 1,2, con proliferación celular. Todo ello hace interesante evaluar la implicación de la ruta de señalización mediada por VHL y MAPK en el CCR. -Determinar la existencia de mutaciones y alteraciones epigenéticas (metilación del promotor) en el gen VHL en tejido renal tumoral de pacientes con carcinoma renal esporádico de célula clara y caracterizar, por western blot y/o inmunohistoquímica, el estado de expresión de las distintas proteínas que forman parte de la vía metabólica de señalización desencadenada por VHL, como CA-IX, HIF-1a y VEGF y de las MAPK implicadas en proliferación como ERK5 y ERK1/2. -Valorar la utilidad de la determinación de la expresión de la proteína CA-IX como biomarcador en el carcinoma de células renales y cuál de los métodos para la detección de su expresión es más útil. -Analizar si la expresión de VHL se asocia con la expresión de las otras proteínas implicadas en su vía de señalización. -Determinar el valor pronóstico y diagnóstico de la existencia de mutaciones y metilación en el gen VHL, así como de la expresión de VHL y de las proteínas de las vías de señalización analizadas. Estudio descriptivo observacional, analítico y transversal sobre 76 pacientes diagnosticados de CCR y tratados quirúrgicamente en el Servicio de Urología del Complejo Hospitalario Universitario de Albacete entre los años 2006 y 2011. Se obtuvieron muestras de tejido tumoral y parénquima renal de los especímenes quirúrgicos. A dichas muestras se les realizó un análisis de expresión de la proteína CA-IX por inmunohistoquímica, además se les extrajo proteína para realizar el análisis de expresión de la misma proteína mediante la técnica de western blot. De esos 76 pacientes se seleccionaron los 50 pacientes diagnosticados de CCRCC a los que se les extrajo ADN para realizar el estudio genético y epigenético de VHL. Para el estudio de las mutaciones del gen se amplificaron los 3 exones que conforman el gen VHL mediante la técnica de PCR y se sometieron secuenciación automática. Para el estudio epigenético se analizó el análisis de hipermetilación de tres amplicones que componen el mayor número de sitios CpG del promotor de VHL. También se extrajo proteína a las muestras tumorales y de parénquima renal sano de esos 50 pacientes, para realizar el análisis de expresión de las proteínas ERK5 y ERK1,2 por western blot; y se realizó un análisis de expresión de las proteínas VHL, HIF-1a y VEGF por inmunohistoquímica. La edad media de los pacientes fue de 64,1 años, afectando un 68,4% a hombres y un 31,6% mujeres. La cirugía realizada mayoritariamente consistió en nefrectomía radical (84,2%). Respecto a la clínica, el hallazgo incidental de los tumores fue la causa más frecuente (55,9%). El tipo histopatológico más frecuente fue el de células claras encontrado en 50 casos (65,8%), seguido del cromófobo (17,1%). En un 40,3% de los casos el grado nuclear de Fuhrman fue el 2. La mayoría de los tumores se situaron por debajo del estadio pT2 siendo el pT1b el más frecuente encontrado en un 34,2% de los casos. El 27,6% de los casos presentaron metástasis a distancia en el momento del diagnóstico. Con respecto al estadio TNM, el estadio I fue el mas frecuente con 39 casos de los 76 (51,3%). En cuanto a la expresión de CA-IX, todos los CCRCC fueron positivos para CA-IX. Podemos considerar ambas técnicas como válidas para el diagnóstico de CCRCC. No se encontró relación entre la expresión de CA-IX y el grado de Fuhrman ni con el estadio pT. Sí se comprobó que en estadios más altos así como en presencia de metástasis había un mayor porcentaje de casos que expresaban la proteína CA-IX. Con respecto al estado mutacional del gen VHL, se detectaron 13 mutaciones (26%) en los 50 pacientes de CCRCC distribuidas en los 3 exones pero con mayor porcentaje en el exón 1 (53,8%) y siendo la deleción la más frecuente (38,5%). Se encontró un mayor número de mutaciones en el riñón derecho. Con respecto al grado de Fuhrman, las mutaciones se dieron con mayor frecuencia en los grados 1 y 2 (p= 0,036). No se observó que la existencia de mutación se correlacionara con estadio pT, pN, pM ni TNM. De 46 pacientes analizados con CCRCC se encontraron 9 pacientes con hipermetilación en el promotor del gen VHL. Apareció hipermetilación en mayor porcentaje en los tumores que presentaron síntomas. Se observó una tendencia lineal entre la presencia de metástasis a distancia y una mayor proporción de casos conhipermetilación del gen VHL. Más del 50% de los casos expresaron la proteína VHL por inmunohistoquímica, los casos que no expresaron VHL correspondieron a tumores con Fuhrman más altos (14,30% de grado 3 y 54,50% de grado 4). La expresión de HIF-1a fue positiva en la gran mayoría de los casos (89,4%), así como la expresión de ERK1,2 (94%). En cuanto a VEGF y ERK5, su expresión correlacionó con estadios TNM avanzados y con la presencia de metástasis. Además la expresión de VEGF se relacionó también con grados de Fuhrman altos. CONCLUSIONES CA-IX es un marcador específico del carcinoma renal de células claras, técnicas como la inmunohistoquímica y de western blot son válidas para su detección pudiendo servir de apoyo a las técnicas diagnósticas de CCRCC basadas en la morfología tumoral. El CCRCC presenta alteraciones en el gen VHL, por mutación y/o metilación, en porcentajes de 26% y 19,6%. Dichas alteraciones no correlacionan con la expresión de la proteína por inmunohistoquímica. La expresión de VHL no se correlacionó con la expresión de las otras proteínas implicadas en la vía de señalización, pero su ausencia se asocia a grados de Fuhrman altos, indicando peor pronóstico. En cuanto a HIF-1a, su diana directa, se expresa en un alto porcentaje en el CCRCC, lo que al igual que CA-IX lo haría buen biomarcador. Las proteínas VEGF y ERK5, pueden establecerse como marcador pronóstico. La expresión de ambas proteínas está correlacionada entre sí y se expresan, en mayor porcentaje, en grados de Furhman y estadios TNM más altos. Además, su expresión está directamente ligada a la presencia de metástasis a distancia