Evaluación del efecto del proceso de sexado sobre espermatozoides de ciervo rojo ibérico y estudio de herramientas complementarias para su mejora

El uso de técnicas de reproducción asistida en cérvidos durante los últimos años ha experimentado un importante avance no solo con propósitos conservacionistas (Jabbour et al. 1997; Pukazhenthi y Wildt 2003), sino también con propósitos económicos (carne, velvet y trofeos) cuya importancia es alta en algunos países como España, Nueva Zelanda, Australia o China (Asher et al. 2000). Esta importancia económica ha generado un interés creciente por parte de los criadores de ciervo a la hora de buscar asesoramiento de especialistas con el fin de desarrollar técnicas que les permitan optimizar sus rendimientos y producciones. Dentro de este contexto, existe una gran variedad de técnicas de reproducción asistida como la electroeyaculación, la sincronización del estro a través del uso de implantes de progestágenos, la inseminación artificial (IA), la transferencia de embriones o la fecundación in vitro (IVF) que han sido objeto de investigación en varias especies de cérvidos (Asher et al. 1999), siendo la más importante tanto para los criadores como para los investigadores el ciervo rojo (Cervus elaphus). Uno de los principales objetivos de la presente tesis doctoral ha sido evaluar el rendimiento y efectos que tiene el proceso de sex-sorting, mediante el uso del sistema (SX MoFlo, DakoCytomation Inc., Fort Collins, CO, USA) modificado para selección espermática, en eyaculados de ciervo rojo obtenidos mediante electroeyaculación. Dicho proceso nos permite separar y clasificar los espermatozoides de eyaculados en fracciones enriquecidas de espermatozoides Y- y espermatozoides X- con una pureza superior al 90%. Estudios previos en cérvidos (Gao et al. 2011) han demostrado que es posible obtener fracciones enriquecidas de espermatozoide Y- con capacidad fecundante y obtener descendencia mediante inseminación artificial en hembras superovuladas. Esta tecnología de sexado espermático es especialmente interesante en especies como el ciervo, en las cuales el interés productivo y en consecuencia el rendimiento económico se obtiene de uno de los sexos. Dado que en el ciervo rojo la principal producción es la cuerna, los machos son los que poseen un elevado valor económico. La posibilidad de elegir el sexo de la descendencia, supondría una enorme optimización de los medios de producción. Además, desde un punto de vista tanto ético como productivo nos permite evitar la eliminación masiva de hembras en las explotaciones. Por estos motivos el sex-sorting espermático se presenta como una herramienta de gran utilidad en la producción de cérvidos. Sin embargo, apenas se han realizado estudios en cérvidos que analicen in-vitro los diferentes efectos que por su amplitud y complejidad puede tener el proceso de sexado sobre espermatozoides de cérvidos. El único ejemplo que podemos encontrar es el trabajo llevado a cabo por Kjelland et al. (2011) donde monitorizan la cinética de fragmentación del DNA y la motilidad espermática en muestras de ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus). Durante el proceso de sex-sorting los espermatozoides se exponen a numerosos factores estresantes tales como; altas tasas de dilución, tinción con sondas fluorescentes, procesos mecánicos a lo largo del citómetro de flujo, la aplicación de cargas eléctricas a las gotas donde se encuentran sumergidos los mismos en el momento de la separación, o la centrifugación necesaria para reconcentrar las muestras. Se presupone que todos estos factores reducen la viabilidad de los espermatozoides y por lo tanto reducen la capacidad de éxito de dicha tecnología (Rath et al. 2009). Además se realizó un segundo estudio en muestras espermáticas sometidas al proceso de sorting sin ser separadas en pureza (BSS) contra semen convencional (NS), ambos sometidos a un proceso de congelación-descongelación. Después de descongelar las muestras, estas se sometieron a un test de estrés que consistió en suplementar las muestras con un agente oxidante (H2O2) dejando un control sin suplementar, y a su vez suplementar las muestras oxidadas y no oxidadas con antioxidantes (Glutatión reducido (GSH) y Trolox) dejando una vez más un control sin oxidante y sin antioxidante. Posteriormente se sometió a las muestras a una incubación de 2 h a 37ºC. El objetivo de este segundo estudio era averiguar si las muestras espermáticas sometidas al proceso de sexado eran más o menos susceptibles al estrés oxidativo y además si esos efectos negativos producidos por un exceso de ROS podían ser contrarrestados con el uso de antioxidantes. Por un lado, un estudio previo (Gosálvez et al. 2011) llevado a cabo en la especie bovina sugirió que tras el proceso de sex-sorting el porcentaje de espermatozoides con DNA dañado disminuía, lo que puede explicarse debido a uno de los pasos intrínsecos del proceso de sex-sorting por el cual se descartan los espermatozoides no viables y mal orientados. Este hecho estaría en consonancia con Lopes M.Sc. et al. (1998) donde concluye que en muestras con mala calidad espermática, el porcentaje de fragmentación del DNA es mayor. Por otro lado, todos los factores estresantes para el espermatozoide comentados anteriormente y que tienen lugar durante el proceso de sexado nos pueden hacer pensar en un aumento de la susceptibilidad al estrés oxidativo. Además, el proceso de congelación al que son sometidas las muestras en la mayoría de los casos debido a razones logísticas, nos hace pensar en un aumento del estrés oxidativo como se ha demostrado previamente en ganado equino (Ball et al. 2001) o en bovino (Chatterjee y Gagnon 2001). Por este motivo nos pareció muy importante, averiguar el grado de susceptibilidad al estrés oxidativo de muestras espermáticas sometidas al proceso de sorting respecto a muestras espermáticas convencionales, y si el uso de antioxidantes pudiera tener efectos beneficiosos a la hora de prevenir daños y mantener la calidad espermática. Otro de los objetivos de la presente tesis doctoral ha sido profundizar en la mejora de los procesos de manejo de muestras espermáticas de ciervo rojo mediante el uso de técnicas como la centrifugación de dichas muestras en gradientes de selección espermática de una sola capa (Androcoll-S) o la adición de sustancias antioxidantes in vitro con el fin de lograr una mejora de la calidad espermática en diferentes etapas de su manipulación. Dentro de este contexto podemos decir que el uso de gradientes de selección de una sola capa como Androcoll® puede convertirse en una herramienta muy importante a la hora de mejorar la calidad espermática en muestras con cierto deterioro, ayudándonos así a seleccionar únicamente células útiles (motiles y viables) y descartando aquellas deterioradas sin función alguna. Esta técnica por lo tanto, podría permitirnos mejorar por un lado los bancos de recursos genéticos (BRG), permitiéndonos una gran optimización de los mismos debido a la capacidad para seleccionar solo aquellos espermatozoides útiles y descartando aquellos que no lo son. Por otro lado nos permite mejorar otras técnicas de reproducción asistida como por ejemplo la fertilización in vitro (FIV), la inseminación artificial o el proceso de sex-sorting. Centrándonos en este último, el uso de gradientes de selección (Androcoll-S en este caso) puede ofrecernos varias ventajas. En primer lugar, nos permitiría llevar a cabo el proceso de sex-sorting en muestras previamente congeladas donde la completa eliminación del medio de congelación es un requisito fundamental puesto que dicho gradiente va a permitirnos seleccionar de la muestra solamente los espermatozoides motiles, descartando en su totalidad el medio de congelación (Glicerol, yema…etc.) (Hollinshead et al. 2004; Morton et al. 2006). Además, el uso de este gradiente va a permitirnos hacer una selección previa, descartando así la gran mayoría de células muertas, y optimizando el proceso de sexado al poder partir de muestras con porcentajes de viabilidad muchos mayores. No hay que olvidar que trabajar con muestras con un bajo porcentaje de células vivas es uno de los mayores problemas del proceso de sex-sorting. Con esta herramienta facilitamos el proceso, haciendo una selección previa y pudiendo aumentar la velocidad y el rendimiento del proceso de sex-sorting per se. De entre los distintos gradientes de selección espermática por centrifugación, hemos seleccionado el Androcoll-S para comprobar su idoneidad en semen de ciervo rojo debido a la gran facilidad de manejo que presenta a priori respecto otros medios de selección espermática bicapa o el swim up. El uso de Androcoll® con formulaciones de coloide especie-especificas ha dado buenos resultados en otras especies tales como: equino (García et al. 2009), bovino (Thys et al. 2009) o caprino (Jiménez-Rabadán et al. 2012). Es por estas razones que desarrollar un gradiente específico para muestras espermáticas de ciervo podría ser una herramienta de gran ayuda como complemento para el desarrollo de otras técnicas de reproducción asistida. Finalmente y como último objetivo de la presente tesis, hemos querido profundizar en el uso de dos antioxidantes (Trolox (TRX) y Glutatión reducido (GSH)) como aditivos y monitorizar in-vitro, en dosis descongeladas de ciervo rojo obtenidas mediante electroeyaculación, el efecto de estos tras someter a dichas muestras espermáticas a un test de estrés mediante una incubación de 2 h a 39ºC. El Trolox es un análogo hidrosoluble de la Vitamina E con alta capacidad de depuración de ROS (Mickle y Weisel 1993) cuya eficacia pudimos comprobar previamente en muestras epididimarias (Anel-López et al. 2012). Habitualmente es usado como antioxidante estándar para comparar la capacidad antioxidante de otros antioxidantes (Lipovac et al. 2000; Prior et al. 2005). Este antioxidante ha demostrado su utilidad a la hora de mejorar la motilidad y la actividad mitocondrial en espermatozoides de porcino como tras la descongelación como demostró Peña et al. (2003). También, ha demostrado su utilidad reduciendo la peroxidación lipídica y preservando la integridad de membrana en espermatozoides epididimarios de ciervo rojo durante una incubación tras la descongelación tanto en muestras con oxidación inducida como en muestras no inducidas (Martinez-Pastor et al. 2009; Martínez-Pastor et al. 2008). Si bien es cierto, dentro del rango de concentración mM podemos decir que el exceso de antioxidación se tradujo en una reducción de calidad en muestras epididimarias (Anel-López et al. 2012). El GSH es un tripéptido que se encuentra distribuido en las células vivas. Tiene un papel muy importante en la protección de las células contra el estrés oxidativo, actuando directamente o como cofactor de la enzima glutatión peroxidasa (Atmaca 2004) reduciendo el H2O2 a H2O y lipoperoxidos a alquil alcoholes. Los buenos resultados obtenidos previamente en muestras epididimarias de ciervo rojo (Anel-López et al. 2012) nos parecieron un buen motivo para probar la eficacia de este antioxidante en muestras obtenidas mediante electroeyaculación, y lo han perfilado como un aditivo de gran valor para la mejora de el manejo de espermatozoides de esta especie. Uno de los principales motivos para profundizar en el uso de antioxidantes ha sido debido a la alta susceptibilidad de los espermatozoides de mamíferos al estrés oxidativo (Baker y Aitken 2004). En este contexto, podríamos definir el estrés oxidativo como la pérdida del balance entre la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y la capacidad de los antioxidantes de una célula para eliminarlos. Esta alta susceptibilidad por parte de los espermatozoides al estrés oxidativo, se traduce en una pérdida de calidad espermática; perdida de motilidad, perdida de la integridad de la membrana plasmática y perdida de la capacidad fecundante (Aitken 1995; Aitken et al. 2012; Baker y Aitken 2004; Rath et al. 2009). Estudios previos, han demostrado que el uso de antioxidantes tuvo efectos beneficiosos sobre muestras espermáticas epididimarias de ciervo rojo tanto en muestras refrigeradas (Fernández-Santos et al. 2009), en muestras suplementadas previamente a la congelación (Anel-López et al. 2012) o en muestras suplementadas tras la descongelación (Domínguez-Rebolledo et al. 2010). El uso de Antioxidantes como aditivo en los medios de manejo espermático ha de valorarse como una herramienta muy importante que puede ayudarnos a optimizar y mejorar el rendimiento del proceso de sex-sorting con todas las ventajas que esto incluiría tales como; la mejora de los tiempos de separación, la mejora de la calidad espermática tras el sex-sorting, y la mejora de la calidad espermática tras la descongelación de muestras sexadas, con el consiguiente aumento de la fertilidad de dichas muestras. Debido a la complejidad del proceso de sex-sorting, donde la calidad de las muestras con las que se va a trabajar juega un papel critico a la hora de obtener un buen rendimiento, además de todos los pasos lesivos a los que son sometidos los espermatozoides durante el propio proceso tales como; altas tasas de dilución, tinción con sondas fluorescentes, procesos mecánicos a lo largo del citómetro de flujo, la aplicación de cargas eléctricas a las gotas donde se encuentran sumergidos los mismos en el momento de la separación, o la centrifugación necesaria para reconcentrar las muestras, nos pareció un paso fundamental para poder elaborar un plan de mejora de dichas muestras espermáticas, realizar un análisis descriptivo de la fisiología de los espermatozoides de ciervo rojo tras ser sometidos a al proceso de sex-sorting. Por estos motivos, quisimos evaluar además, el efecto de 2 herramientas que podrian ayudarnos en un futuro a mejorar los protocolos de sex-sorting espermático. Por un lado, comprobar in vitro el efecto de 2 antioxidantes en muestras espermáticas de ciervo rojo obtenidas mediante electroeyaculación y sometidas a un proceso de congelación-descongelación. Por otro lado, evaluar el efecto del la técnica de selección espermática por centrifugación con Androcoll-S. Esta técnica, podria ayudarnos a realizar el proceso de sexado en muestras que por motivos logísticos hayan tenido que ser previamente congeladas, ya que nos permite desechar por completo el medio de congelación, quedándonos solo con aquellas células útiles (viables y motiles). Además, nos permite mejorar la calidad espermática de una muestra deteriorada, desechando aquellos espermatozoides muertos, lo que podria ser de gran ayuda a la hora de mejorar el rendimiento del proceso de sex-sorting, ya que la buena calidad de la muestra de partida es un factor critico a la hora de obtener buenos rendimientos con esta técnica. CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN En el primer capitulo de la presente tesis doctoral hemos estudiado el efecto del proceso de sexado (mediante un sistema de citometría de flujo SX MoFlo, DakoCytomation Inc. Fort Collins, CO, USA) en muestras espermáticas de ciervo rojo. Las muestras fueron obtenidas de 10 machos adultos en época reproductiva mediante electroeyaculación Se evaluaron varios parámetros de calidad espermática in-vitro entre muestras sometidas al proceso de sexado pero no separadas (BSS), muestras espermáticas separadas en pureza Y (YSS), muestras separadas en pureza X (XSS) y muestras espermáticas convencionales no sometidas al proceso de sorting (NS). Todos los grupos experimentales se sometieron a un proceso de congelación en vapores de nitrógeno. Tras la descongelación, las muestras YSS no mostraron diferencias significativas (P<0.05) para la motilidad total respecto al BSS ni al grupo NS, en cambio las muestras XSS mostraron un descenso significativo de la misma respecto a los otros 3 grupos experimentales. La motilidad espermática disminuyo para los 4 grupos experimentales tras someter las muestras a una incubación de 2 h a 37 ºC. Además, el porcentaje de espermatozoides apoptóticos tras la incubación fue mas alto para las muestras XSS que para el resto. El porcentaje de espermatozoides con alto daño en la cromatina (%DFI) fue similar entre los 4 grupos experimentales tras la descongelación e incrementó tras la incubación para todos los grupos menos para las muestras YSS. Debido a la ausencia de grandes diferencias en los parámetros de calidad analizados in-vitro se planteo una segunda parte donde se realizaron inseminaciones artificiales en ciervas con muestras YSS y BSS. Una semana antes del parto las hembras fueron estabuladas individualmente y la identificación del sexo se llevo a cabo sobre las crías paridas. El porcentaje de machos paridos de las muestras YSS fue del 93%. La fertilidad fue significativamente superior para el grupo BSS (51%) respecto al YSS (43%). Los objetivos del segundo capitulo de la presente tesis doctoral fueron evaluar la susceptibilidad al estrés oxidativo de las muestras espermáticas sometidas a un proceso de sex sorting, y evaluar el efecto de la adición de 2 sustancias antioxidantes [glutatión reducido (GSH) y trolox (TRX)] en dichas muestras espermáticas. Se utilizaron muestras espermáticas de 3 machos adultos en época reproductiva obtenidas por electroeyaculación. De cada muestra, la mitad del eyaculado fue procesado como semen convencional NS y la otra mitad fue sometida a un proceso de sorting BSS. Posteriormente ambos grupos fueron congelados. Tras la descongelación se realizo una evaluación de parámetros espermáticos como la motilidad, viabilidad o fragmentación de la cromatina. La susceptibilidad al estrés oxidativo se midió mediante la adición de H2O2 a 2 concentraciones diferentes(H2O2 0 mM = H000; H2O2 50 mM = H050; H2O2 100 mM = H100) en el medio de congelación y se incubo 2 h a 37 ºC. Tras la descongelación la motilidad espermática mostro mejores valores (P<0.05) para las muestras convencionales NS (59%±3.3) respecto muestras BSS (36.9%±5.8). Ademas, el porcentaje de espermatozoides con marcadores apoptóticos fue significativamente mas alto para las muestras BSS (21.6%±5.0) que para las muestras convencionales NS (14.6%±1.2). El porcentaje de espermatozoides con una alta fragmentación de la cromatina se vio incrementado por la presencia de H2O2 en las muestras convencionales NS (H000=4.1%±0.9; H050=9.3%±0.7; and H100=10.9%±2.3) no siendo así para las muestras BSS, que mostraron mas resistencia al estrés oxidativo inducido que las muestras convencionales. Por otro lado la adición de GSH protegió la motilidad espermática en presencia de oxidante tras la incubación para ambos tipos de muestras (NS y BSS). Estos resultados mostraron que el proceso de sorting produce un daño subletal en espermatozoides de ciervo rojo pero a la vez selecciona un población de espermatozoides con una cromatina mas resistente al estrés oxidativo que las muestras convencionales. Por su parte, el GSH a una concentración de 1 mM mostró buenos resultados manteniendo valores mas altos de motilidad en aquellas muestras sometidas a un estrés oxidativo mediante la adición de H2O2, no siendo así para el TRX que mostro un fuerte efecto inhibiendo la motilidad espermática. En los capítulos tercero y cuarto de la presente tesis doctoral, hemos evaluado 2 herramientas adicionales (selección espermática por centrifugación con Androcoll-S y la adición de 2 sustancias antioxidantes a los medios de manipulación espermática) para la mejora de la calidad espermática y sus efectos en muestras espermáticas de ciervo rojo, para quizá en un futuro poderlas usar como una parte importante de los protocolos sex sorting con el objetivo de mejorar sus rendimientos. La selección espermática con coloides monocapa mediante la centrifugación es una técnica de gran utilidad para mejora la calidad espermática. El uso de estos medios de selección tales como el Androcoll-S podria convertirse en un herramienta de gran utilidad para la mejora de la calidad espermática y en consecuencia para mejorar otras técnicas de reproducción asistida como el se sorting espermático o la fecundación in-vitro (FIV). Por estos motivos, el objetivo del tercer capitulo fue evaluar el efecto del Androcoll-S en muestras espermáticas de ciervo rojo obtenidas mediante electroeyaculación y post-mortem tras someterlas a un proceso de congelación-descongelación y a una incubación de 2 h a 37 ºC. Las muestras seleccionadas con Androcoll-S, mostraron una importante mejora en los parámetros de movilidad analizados respecto a las muestras no analizadas, tanto en el tiempo 0, nada mas hacer la selección, como tras someter las muestras a la incubación. El mismo efecto se observo en otros parámetros como la viabilidad, la actividad mitocondrial o la integridad acrosomal que mejoraron significativamente (P