Caracterización genética y estudio de actividades enzimáticas de levaduras vínicas. Mejora de una cepa de S. cerevisiae con el gen PGU1

En esta tesis se han abordado los siguientes objetivos: I. Aislamiento de levaduras saccharomyces y no saccharomyces a partir de mosto y vino e identificación mediante pcr-rflp. Los aislados se caracterizaron además por pcr-ttge existiendo una buena concordancia entre las técnicas moleculares. Ii. Caracterización directa de la población levaduriforme presente en un tanque de fermentación vínica mediante las técnicas anteriores. Esta aproximación se mostro valiosa por su rapidez y la posibilidad de detectar cepas no saccharomyces que no se habían puesto de manifiesto por plaqueo. Iii. Estudio de la actividad poligalacturonasica en cepas vínicas de saccharomyces cerevisiae. En las 61 cepas probadas, se hallo un gran variabilidad de resultados, para ello se puso a punto un método de cuantificación sencillo y repetitivo empleando acido poligalacturonico como sustrato. Por otra parte se analizo por pcr y southern la presencia del gen pgu1, responsable de la actividad poligalacturomasica, mostrando que habían cepas que lo poseían y no expresaban dicha actividad y otras en las que no se amplificaba y que no tenían actividad, por lo que la presencia del gen podría utilizarse como un marcador genético. Iv. La cepa que mostro una mayor actividad bajo diferentes parámetros enológicos se utilizo como donante para la transformación de otra vínica con buenas cualidades enológicas y que no poseis el gen pgu1. Se secuencio el gen responsable de la actividad y se hallo una mutación a nivel del nucleotido +877: a-g que confiere el cambio de un aminoácido en la secuencia proteinica (ser 293-gly). Por otra parte se sustituyo el promotor por el del gen pgk1 de s cerevisiae con el fin de aumentar su expresión en condiciones de fermentación. La cepa vínica receptora, que adquirió resistencia al sulfometuron metil, se transformo con el fragmento lineal smri-pgk1-pgu1 y la integracion se dirigio al locus ilv2, con lo que se recuperaba el fenotipo original. Con la cepa modificada no transgénica, se microvinifico sobre mosto blanco y tinto, encontrando que la extracción del color y el rendimiento en mosto eran significativamente superiores mientras que el contenido en etanol y en los volátiles analizados no vario. V. Se estudio cuali y cuantitativamente in vitro la actividad b-glicosidasica en cepas de s cerevisiae, encontrando que algunas de ellas podían romper los enlaces glucosídicos de algunos de los sustratos sintéticos probados dependiento de las condiciones de crecimiento. Por otra parte, se analizo la hidrolisis de los glicosidos de un mosto moscatel por distintas levaduras saccharomyces y no saccharomyces. De todas las cepas ensayadas, hanseniaspora uvarum, fue la que libero una gama de volátiles mas amplia analizados por cg-ms. Por último, se fraccionaron los precursores aromáticos glicosilados de uvas blancas de variedades neutras mediante su hidrolisis química, enzimática y por el extracto celular de una cepa vínica. Esta última fue capaz de liberar algunos compuestos bencenicos (acetovanillona), norisoprenoides (vomifoliol) y terpenos como el linalol, nerol o geraniol. Estos resultados abren una puerta en la interpretación de los procesos que tienen lugar durante la fermentación y prueban la importancia de las levaduras en la liberación de los precursores del aroma y por lo tanto en la expresión de las características varietales de las uvas