Isolation and characterizacion of enzymes involved in the biosynthesis of secondary metabolites with phytotherapeutic interest

Isolation and characterization of enzymes involved in the biosynthesis of secondary metabolites with phytotherapeutic interest. Las plantas medicinales han sido utilizadas como primer recurso sanitario desde la antigüedad. En los últimos años el interés de la industria farmacéutica por los productos naturales o metabolitos secundarios provenientes de plantas medicinales, se ha incrementado considerablemente, entre las que se incluyen el azafrán. Se conoce como especia azafrán a los estigmas secados y tostados de Crocus sativus. En el estigma se acumulan una gran cantidad de metabolitos secundarios, siendo los más abundantes los apocarotenoides y en menor medida los flavonoides. En esta Tesis Doctoral se describe el aislamiento y caracterización de diferentes enzimas involucradas en la biosíntesis y modificación de metabolitos secundarios de Crocus sativus que poseen interés para la industria farmacéutica. El primer capítulo describe la caracterización y el clonaje de una glucosiltransferasa (UGT75P1) presente en Crocus sativus in vitro, UGT75P1 cataliza la transferencia de una glucosa desde UDP-Glucosa a los flavonoides kampferol y quercetina, con una marcada regioselectividad. El kaempferol es el único flavonol presente en los estigmas de C. sativus y los niveles de sus glucósidos cambian a lo largo del desarrollo del estigma, estos cambios, se correlacionan con los niveles de expresión de UGT75P1 durante las diferentes etapas del desarrollo. En el segundo capítulo se presenta la caracterización genómica de la familia de dioxigenasas de corte de carotenoides de tipo 4 (CCD4) presente en distintas especies vegetales y caracterizada bioquímicamente por primera vez en Crocus sativus. Estas CCD4s están implicadas en el corte de los dobles enlaces C9,C10 y C9¿,C10¿ de compuestos carotenoides cíclicos, generando compuestos volátiles del tipo C13 ketonas como la ß-ionona. En C. sativus se han aislado diferentes alelos de CDD4, que muestran diferencias en su organización génica y se han comparado sus promotores con los de genes que codifican para otras CCD4 en distintas plantas. La elaboración de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana con el promotor CsCCD4a fusionado al gen GUS ha permitido estudiar la actividad del promotor en diferentes tejidos de la planta. En el tercer capítulo se describe la evolución de distintos apocarotenoides y de distintos compuestos volátiles durante la senescencia de las flores de C. sativus. Se observó que durante el proceso de senescencia de la flor tiene lugar un transporte de apocarotenoides desde los estigmas hacia los ovarios, y de estos hacia el nuevo cormo en desarrollo. Por lo tanto, en ausencia de fertilización y desarrollo de la semilla, una parte del material es reutilizado, transportándose hacía los tejidos en proceso de desarrollo. El cuarto capítulo muestra la caracterización de una nueva glucosiltransferasa (UGT707B1) aislada de estigmas de C. sativus. Los transcritos de UGT707B1 fueron detectados en el estigma de todas las especies de Crocus analizadas, pero el análisis de la expresión de UGT707B1 en tépalos reveló su ausencia en determinadas especies. El análisis de los flavonoides presentes en los tépalos de las distintas especies de Crocus revela que la expresión de UGT707B1, está asociada a la presencia de los flavonoles glucosilados: kaempferol-3-O-ß-D-glucopiranosil-(1-2)-ß-D-glucopiranósido y quercetina-3-O-ß-D-glucopiranosil-(1-2)-ß-D-glucopiranósido, El análisis de plantas transgénicas de A. thaliana que expresan constitutivamente UGT707B1 bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de coliflor, refuerzan la implicación de UGT707B1 en la biosíntesis de flavonol-3-O-sophorosidos. Así mismo, los fenotipos de estas plantas transgénicas demuestran cómo cambios en la homeostasis de determinados flavonoides pueden provocar importantes cambios en el desarrollo vegetal, principalmente de aquellos asociados al transporte y distribución de auxinas. El quinto capítulo se ha procedido a la búsqueda in silico de nuevas enzimas con actividades de glucosiltransferasa o glucosidasa presentes en el estigma de C. sativus utilizando herramientas bioinformáticas y de una base de datos de más de 65000 secuencias parciales obtenidas durante el proceso de secuenciación masiva de transcritos de seis estadios de desarrollo del estigma de azafrán, realizada en colaboración con el laboratorio del Dr. G. Giuliano (Green Biotechnology of ENEA, Italia). Este trabajo se ha realizado durante una estancia predoctoral de tres meses en dicho laboratorio. Todos los resultados recogidos en esta tesis doctoral tienen como finalidad conocer mejor los mecanismos de la regulación de la biosíntesis de los metabolitos secundarios de Crocus sativus con interés farmacológico e industrial, así como determinar los genes implicados en su biosíntesis. Esta información constituye una valiosa herramienta biotecnológica para la industria farmacéutica. Bibliografía destacada 1. Duroux L, Delmotte F, Lancelin J, Keravis G, Jay-Allemand C: Insight into naphthoquinone metabolism: beta-glucosidase-catalysed hydrolysis of hydrojuglone beta-D-glucopyranoside. Biochemical Journal 1998, 333(Pt 2):275. 2. Leah R, Kigel J, Svendsen I, Mundy J: Biochemical and molecular characterization of a barley seed b-glucosidase. J Biol Chem 1995, 26:15789-15797. 3. Winterhalter P, Skouroumounis G: Glycoconjugated aroma compounds: occurrence, role and biotechnological transformation. Biotechnology of aroma compounds 1997:73-105. 4. 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