Nanosistema de entrega de fármacos para tratamento de infeções por HPV

Sequências de oligonucleótidos de DNA e RNA ricas em guaninas podem associar-se inter ou intramolecularmente para formar estruturas de quatro cadeias que se designam G-quadruplex (G4). Vários oligodesoxinucleótidos de G4 têm sido alvo de estudo como potenciais agentes diagnóstico e terapêuticos funcionando como aptameros, pois têm interação específica com proteínas alvo que podem encontrar-se à superfície das células. Entre estes alvos está a nucleolina (NCL), proteína multifuncional sobrexpressa à superfície das células cancerosas, sendo por isso um alvo para o desenvolvimento estratégias para o diagnóstico e terapia do cancro. Entre os diversos aptameros G4 destaca-se o AS1411, que é um aptamero que se liga à NCL e inibe o crescimento de células cancerosas sem afetar as células normais, tendo sido alvo de ensaios clínicos humanos de fases 1 e 2. O seu comportamento seletivo tem sido de particular interesse nos últimos anos para a entrega de agentes terapêuticos ou de imagem em células cancerosas; pelo que a procura de novas estratégias com vista a melhoria das propriedades deste aptamero G4 é um foco de estudo crescente. As modificações químicas no G4 AS1411 e a formação dos conjugados com ligandos de G4, constituem uma estratégia promissora para explorar o seu potencial terapêutico e constituem a base para a formação e otimização de nanosistemas conjugados aptamero-ligando. Neste trabalho são reportados ensaios biofísicos e in vitro de derivados de fenantrolina e derivados de laranja de acridina usados para estabilizar um derivado do AS1411, designado AT11-L0. Também é proposta a síntese de novos ligandos derivados de fenantrolina. Relativamente aos ensaios biofísicos, a espectroscopia de discroísmo circular (CD) confirmou a existência de uma estrutura G4 paralela para o AT11-L0 em tampão 65 mM KCl + 20 mM K2HPO4/KH2PO4. As experiências de CD-melting demonstraram que os ligandos que provocaram maior estabilização térmica da estrutura do G4 AT11-L0 foram os derivados de laranja de acridina C8-NH2 e o C8, com ?Tm = 26,6 ºC e 23,9 ºC, respetivamente a 4 equivalentes molares. As titulações de fluorescência indicaram valores de KD entre 10-6 - 10-7 (M-1) para os ligandos derivados de laranja de acridina e de fenantrolina, indicativos de ligandos de G4 com afinidade média a elevada. Sendo que, os ligandos com maior afinidade para o AT11-L0 foram o derivado de laranja de acridina C8-NH2 (KD = 3,2×10-7 (M-1)) e o derivado de fenantrolina [32]phen2N4 (KD = 2,7×10-7 (M-1)). Já os ensaios in vitro foram levados a cabo em células HeLa vs NHDF. Foram realizados ensaios de citotoxicidade (MTT) para determinar o IC50 dos ligandos C8-NH2, C8, C5, C3 e [16]phenN2 e posteriormente para avaliar a citotoxicidade dos conjugados AT11-L0-C8, AT11-L0-C8-NH2, AT11-L0-C5, AT11-L0-C3. Os ligandos demonstraram ser citotóxicos para ambas as linhas celulares, com valores de IC50 entre 0,15 µM e 3,51 µM. Os nanosistemas conjugados aptamero-ligando demonstraram ser citotóxicos e seletivos para células HeLa. Foram ainda levados a cabo estudo de colocalização em células HeLa com o conjugado AT11-L0 - C8, através de microscopia de fluorescência confocal. Verificou-se localização preferencial dos ligandos no nucléolo das células HeLa, a internalização do aptamero AT11-L0, bem como a formação do conjugado aptamero-ligando e a sua internalização nas células. No geral, estes resultados demonstraram ser promissores para o desenvolvimento de futuros nanosistemas envolvendo aptameros G4 derivados do AS1411, conjugados com ligandos de G4 derivados de laranja de acridina e de fenantrolina.Guanine-rich DNA and RNA sequences may associate intermolecularly or intramolecularly to form four-chain structures, designated G-quadruplex (G4). Several oligodeoxynucleotides with this intrinsic capacity have been studied as potential diagnostic and therapeutic agents working as aptamers, since they have specific interaction with target proteins that may be expressed on the surface of cells. Among these targets there is nucleolin (NCL), a multifunctional protein that overexpresses the surface of cancer cells and it is a target for the development of strategies for cancer diagnosis and therapy. Among all the G4 aptamers there is AS1411, which is an anti-NCL aptamer that inhibits the growth of cancer cells without affecting normal cells and it was reached human clinical trials phases 1 and 2. Its tumour-selective behavior has been of interest in recent years for delivery of imaging or therapeutic agents in cancer cells; therefore, the search for new strategies to improve this G4 aptamer properties is a focus of growing study. The chemical modifications in G4 AS1411 and its conjugation with G4 ligands constitute a promising strategy to exploit its therapeutic potential and constitute the basis for aptamer-ligand conjugated nanosystems formulation and optimization. In this work biophysical and in vitro studies of phenanthroline derivatives and orange acridine derivatives used to stabilize an AS1411 derivative, designated AT11-L0, are reported. The synthesis of new ligands derived from phenanthrolines is also proposed. In biophysical assays, circular dichroism spectroscopy (CD) confirmed the existence of a G4 parallel structure to AT11-L0 in 65 mM KCl + 20 mM K2HPO4 / KH2PO4 buffer. CD-melting experiments demonstrated that the ligands that caused the greatest thermal stabilization of the structure of G4 AT11-L0 were the acridine orange derivatives C8-NH2 and C8, with ?Tm = 26.6 ° C and 23.9 ° C, respectively in presence of 4 molar equivalents. Fluorescence titrations indicated KD values between 10-6 - 10-7 (M-1) for both acridine orange and phenanthroline derivatives, which is indicative of medium to high affinity G4 ligands. The ligands with the highest affinity for AT11-L0 were the acridine orange derivative C8-NH2 (KD = 3.2 × 10-7 (M-1)) and the phenanthroline derivative [32]phen2N4 (KD = 2.7 × 10-7 (M-1)). In vitro assays were performed on HeLa vs NHDF cells. Cytotoxicity assays (MTT) were performed to determine the IC50 of C8-NH2, C8, C5, C3 and [16]phenN2 ligands and thereafter to evaluate the cytotoxicity of the conjugates AT11-L0 - C8, AT11-L0 - C8-NH2, AT11-L0 - C5, AT11-L0 - C3. Ligands were shown to be cytotoxic to both cell lines, with IC50 values between 0.15 µM and 3.51 µM. Aptamer-ligand conjugated nanosystems have been shown to be cytotoxic and selective for HeLa cells. A colocalization study in HeLa cells with the AT11-L0 - C8 conjugate was carried out by confocal fluorescence microscopy. Preferred localization of the ligand in the HeLa cell nucleolus, the internalization of the AT11-L0 aptamer, as well as the formation of the aptamer-ligand conjugate and its internalization into the cells were evidenced. Overall, these results have been shown to be promising for the development of future nanosystems involving G4 aptamers derived from AS1411, conjugated to G4 ligands which are acridine orange and phenanthroline derivatives