Criopreservação de oócitos: comparação do efeito de diferentes protocolos após vitrificação

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaA criobiologia e as tecnologias da reprodução podem contribuir para a preservação dos recursos genéticos animais, através da aplicação de programas de conservação da vida selvagem e dos animais domésticos. Estes programas pretendem evitar a extinção de espécies ou raças e conservar gâmetas ou embriões de animais de elevado valor genético. Na medicina humana, cada vez mais a criopreservação é procurada por mulheres em risco de perder a função ovárica, devido a infertilidade precoce causada por tratamentos cirúrgicos, radioterapia ou quimioterapia. Contudo a criopreservação de oócitos ainda apresenta uma baixa taxa de sucesso. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da utilização de diferentes combinações de crioprotetores (CPAs), etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e 1,2-propanediol (PROH) na criopreservação de oócitos bovinos e sua consequente repercussão na maturação dos oócitos, na viabilidade mitocondrial e no desenvolvimento embrionário posterior. Para isso, foram realizadas duas experiências onde se testam três protocolos de vitrificação: EG+DMSO+sucrose, EG+PROH+sucrose e DMSO+PROH+sucrose. Na experiência 1, os oócitos maturados foram submetidos ao processo completo de vitrificação/aquecimento. Na experiência 2, para estudar o efeito do choque osmótico e da toxicidade dos CPAs independentemente do efeito do frio, realizaram-se os mesmos procedimentos da experiência 1, à exceção da imersão em azoto líquido. Um grupo controlo, sem tratamento ou vitrificação, decorreu em ambas as experiências. Os oócitos foram inseminados com sémen descongelado e, após cultura, foram avaliadas as taxas de embriões. O estadio de maturação e o potencial de membrana interna mitocondrial foram avaliados após a vitrificação/aquecimento na experiência 1 e após o choque osmótico na experiência 2. A técnica de vitrificação (P=0,004) foi superior no grupo EG+DMSO relativamente aos grupos DMSO+PROH (P=0,002) e EG+PROH (P=0,01). Contudo, os três grupos de CPAs obtiveram taxas de clivagens inferiores ao controlo (P<0,0001, experiência 1). Na experiência 2, as taxas de clivagem do grupo DMSO+PROH foram tendencialmente inferiores ao grupo EG+DMSO (P=0,0588). Na experiência 1 verificou-se um efeito significativo dos CPAs (P=0,02), nomeadamente um efeito negativo do EG+PROH (P=0,004) e do DMSO+PROH (P=0,03) no potencial de membrana interna mitocondrial dos oócitos comparativamente ao controlo. Por último, na experiência 1, embora não se tenham verificado diferenças entre grupos nos estadios de maturação, observou-se um aumento de anomalias cromossómicas nos grupos EG+DMSO (P=0,001) e DMSO+PROH (P=0,0004) comparativamente com o grupo controlo. Assim conclui-se que o protocolo mais eficaz para a vitrificação de oócitos é composto pela combinação dos CPAs EG+DMSO. No entanto deverá prosseguir a investigação do efeito da interação dos CPAs de forma a otimizar a viabilidade dos oócitos criopreservados.Cryobiology and breeding technologies can contribute to the preservation of animal genetic resources, through the application to wildlife and domestic animals conservation programs. These programs intend to prevent the extinction of species or breeds and to preserve gametes or embryos of animals of high genetic value. In human medicine, cryopreservation is increasing in demand by women at risk of losing ovarian function due to early infertility caused by surgical treatments and radio- or chemotherapy. However, the cryopreservation of oocytes still has a low success rate. This work intent to study the effect of different cryoprotectants (CPAs) mixtures, ethylene glycol (EG), dimethylsulfoxide (DMSO) and 1,2-propanediol (PROH) on cryopreservation of bovine oocytes and consequent effects on oocyte maturation, mitochondrial viability and embryonic development. Thereby, two experiments were performed to test three protocols: EG+DMSO+sucrose, EG+PROH+sucrose and DMSO+PROH+sucrose. In experiment 1, mature oocytes were submitted to the complete cooling/warming processes. In experiment 2, the same procedures were performed except for the immersion in liquid nitrogen, to study the effect of osmotic shock and toxicity of CPAs independently of the cold effect. In both experiments, a control group, without treatment or vitrification, run simultaneously. The oocytes were inseminated with frozen-thawed semen and, after culture, the embryo rates were evaluated. The oocyte maturation stages and the mitochondrial inner membrane potential were evaluated after cooling/warming in experiment 1 and after the osmotic shock in experiment 2. The efficiency of the vitrification technique was higher in the EG+DMSO group (P=0.004) compared to the DMSO+PROH (P=0.002) and EG+PROH (P=0,01) groups. However, these groups had lower cleavage rates compared to the control (P