Contribution to the study of mouse liver chemical carcinogenesis

Tese de Doutoramento em Ciências da Terra e da VidaO cancro é a primeira causa de morte nos países desenvolvidos e a segunda nos países em desenvolvimento. O cancro primário do fígado representa cerca de 4% dos novos casos diagnosticados mundialmente. Contudo, entre os tumores malignos primários do fígado, o carcinoma hepatocelular (CHC) e a neoplasia maligna mais comum e com mau prognostico clínico. Não obstante as campanhas de promoção e educação para a saúde, mais de meio milhão de novos casos de CHC são reportados anualmente, estimando-se um crescimento de forma continua ate 2020. A alta incidência desta neoplasia agressiva pode estar relacionada com exposição a fatores de risco conhecidos, incluindo compostos cancerígenos, tais como as N-nitrosaminas, que causam danos no ADN. Estes compostos afetam o metabolismo mitocondrial perturbando o equilíbrio entre espécies reativas de oxigénio (ROS) e antioxidantes, causando stresse oxidativo, induzindo danos no ADN, levando potencialmente à hepatocarcinogénese. Contudo, a histogénese do CHC constitui um assunto de aceso debate. A expressão das citoqueratinas (CKs) 7 e 19 é frequentemente associada a um comportamento biológico agressivo, pelo que se propõe refletir na possível origem em células progenitoras ou na desdiferenciação do tumor num fenótipo primitivo. Tendo por base o cenário descrito, e o facto de alguns aspetos da evolução do CHC e processos de metastização serem ainda desconhecidos, os modelos animais assumem um papel crucial para a melhor compreensão desta doença e na testagem de novos fármacos. Considerando que nenhum modelo cumpre todos os propósitos de investigação do CHC, torna-se crucial definir critérios relativos ao modelo animal a adotar, dependendo das opções e fins de pesquisa. O murganho constitui um modelo animal quimicamente induzido pela N-dietilnitrosamina (DEN) que tem sido utilizado em estudos sobre a carcinogénese hepática, nomeadamente no caso do CHC, devido a sua semelhança histológica e genética face aos tumores humanos. A nossa investigação centrou-se nas diferentes etapas relacionadas com a hepatocarcinogénese, usando a DEN, sem recurso a qualquer agente promotor, proporcionando um contributo ao enquadramento sistemático existente sobre modelos animais e carcinogénese química. Para esse efeito, murganhos (ICR) machos foram aleatoriamente divididos em seis grupos de controlo e em seis grupos expostos a DEN. Foram preparadas uma solução salina e uma solução de DEN que foram injetados por via intraperitoneal, respetivamente em cada grupo, durante oito semanas consecutivas. Dois grupos (DEN vs. controlo) foram sacrificados as 8, 15, 22, 29, 36 e 40 semanas após a primeira administração. Foram colhidas amostras de fígado de cada grupo em momentos temporais consecutivos. A atividade da albumina plasmática, bilirrubina total, alanina transaminase e aspartato aminotransferase foram medidas e a bioenergética mitocondrial e stresse oxidativo do fígado foram avaliados. A DEN induziu alterações na bioenergética hepática e na sua capacidade antioxidante face as espécies reativas de oxigénio, sete semanas apos a última administração intraperitoneal. A bilirrubina total plasmática aumentou significativamente no grupo exposto a DEN e a atividade dos complexos mitocondriais I e IV foi inibida significativamente (p = 0,0403 e p = 0,0053, respetivamente). Nesta fase inicial, o tecido hepático dos murganhos expostos a DEN possuía ainda a capacidade de neutralizar os efeitos oxidativos deste composto químico por via do incremento da atividade dos antioxidantes. Contudo, o efeito tóxico da DEN revelou-se em lesões precoces e, a partir da semana 29, em lesões proliferativas progressivas. Entre a semana 15 e 29, os animais expostos a DEN revelaram mudanças significativas ao nível da atividade dos antioxidantes hepáticos (glutatião, glutatião redutase e catalase) (p <0,05) comparativamente com os controlos. Estes resultados apontam para uma ligação entre o aumento do stresse oxidativo induzido pela DEN e as alterações histopatológicas inicialmente observadas, sugerindo que DEN desencadeou um desequilíbrio no mecanismo de defesa antioxidante, estimulando a carcinogénese hepática. A observação de cortes histológicos revelou lesões pré-neoplásicas nos fígados do grupo de murganhos exposto a DEN. Degenerescência hidrópica, necrose e apoptose foram associadas a uma resposta aguda induzida a partir das oito semanas e em diante. Focos hiperplásticos ocorreram a partir das 29 as 40 semanas, observando-se em simultâneo, áreas de displasia difusa e adenoma hepatocelular (as 29 semanas). Peliose hepática foi igualmente identificada as 36 e 40 semanas. Apenas a partir das 40 semanas foi possível observar-se CHC, mostrando características histológicas especificas de malignidade. As CKs 7 e 19 apresentaram padrões de expressão idênticos, localizados em hepatócitos grandes e maduros, isolados ou em pequenos grupos. Os focos hiperplásticos e o único adenoma hepatocelular foram consistentemente negativos para ambos os marcadores, enquanto que nas áreas de displasia e de CHC foram positivos. Estes resultados apoiam a hipótese que a expressão das citoqueratinas 7 e 19 em tumores hepatocelulares resulta de um processo de desdiferenciacão, em vez de uma eventual origem numa célula progenitora. Os resultados permitiram estabelecer uma linha temporal progressiva das alterações e evolução histológica das lesões hepáticas induzidas pela DEN (desde as lesões iniciais até as neoplasias malignas), em murganhos com cinco semanas de idade, sem recurso a um agente promotor, e sua correlação com stresse oxidativo.Cancer is the first cause of death in developed countries and the second in developing countries. Concerning the most frequent worldwide-diagnosed cancer, primary liver cancer (PLC) represents approximately 4% of all new cancer cases diagnosed globally. However, amongst PLC, hepatocellular carcinoma (HCC) is by far the most common malignancy with poor clinical outcome. Notwithstanding the health promotion and disease prevention campaigns, more than half a million new HCC cases are reported yearly, being estimated to growth continuously until 2020. The high incidence of this aggressive malignancy might be related to exposure to known risk factors, including carcinogenic compounds, such as Nnitrosamines, which cause DNA damage. N-nitrosamines affect mitochondrial metabolism disturbing the balance between reactive oxygen species (ROS) and antioxidants, causing oxidative stress and DNA damage, potentially leading to carcinogenesis. However, HCC histogenesis is a subject of intense debate. The expression of cytokeratins (CKs) 7 and 19, associated with aggressive biological behaviour, is proposed to reflect a possible progenitor cell origin or tumor dedifferentiation towards a primitive phenotype. Taking this scenario under consideration and the fact that some aspects concerning HCC evolution and metastasize process are still unknown, animal models assume a crucial role to understand this disease. The animal models have also provided the opportunity to screen new therapeutic strategies. Nevertheless, taking under consideration that no model fulfills all HCC research purposes, it is crucial to define criteria concerning the ideal animal model, depending on the researchers’ options. The chemically induced mouse model of N-diethylnitrosamine (DEN) provides useful insights into liver carcinogenesis, namely HCC due to its histological and genetic resemblance to human tumors. Our research aimed to study the multistep process of hepatocarcinogenesis, using DEN as chemical carcinogen without any promoter agent, providing a systematic framework for animal studies on this subject. For this purpose, male ICR mice were randomly divided into six DEN-exposed and six matched control groups. Saline solution and DEN were injected intraperitoneally, respectively, for eight consecutive weeks. Two groups (DEN vs. control) were euthanized at 8, 15, 22, 29, 36 and 40 weeks after the first administration. Liver samples were taken from each group at consecutive time points. Plasma albumin, total bilirubin, alanine transaminase and aspartate aminotransferase activity were all measured and liver mitochondrial bioenergetics and oxidative stress were also evaluated. DEN induced changes in liver bioenergetics and antioxidant capacity towards reactive oxygen species at seven weeks after last administration. Total plasma bilirubin increased significantly in the group exposed to DEN and mitochondrial complex I and IV were significantly inhibited (p=0.0403 and p=0.0053, respectively). At this initial stage, liver tissue in mice exposed to DEN still had the ability to counteract the oxidative effects of this chemical by increasing the activity of antioxidant enzymes. Nevertheless, DEN resulted in early toxic lesions and, from week 29 onwards, in progressive proliferative lesions. Between 15 and 29 weeks, DEN-exposed animals showed significant changes in hepatic antioxidant (glutathione, glutathione reductase, and catalase) status (p