Resistência a antibióticos e factores de virulência em estirpes comensais de enterococcus spp. de crianças saudáveis

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica LaboratorialO problema da resistência bacteriana aos antibióticos tem-se mostrado cada vez mais preocupante em saúde pública. O uso desmedido e irresponsável dos antibióticos é, em grande parte, responsável por esta situação, tornando o problema grave e reportando-se cada vez mais a casos de multirresistência. Tendo como objectivo principal o estudo da resistência aos antibióticos e dos factores de virulência de estirpes comensais de Enterococcus spp. de crianças saudáveis com idades compreendidas entre os um e 14 anos, desenvolveu-se este trabalho na Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro numa cooperação entre o Centro de Ciência Animal e Veterinária (CECAV) e o Instituto de Biotecnologia e Bioengenharia – Centro de Genética e Biotecnologia (IBB) dessa mesma universidade e o Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro. Um dos objectivos deste estudo foi a pesquisa de estirpes de Enterococcus spp resistentes à vancomicina (VRE´s) com o genótipo vanA isoladas a partir de amostras fecais das referidas crianças. Utilizaram-se placas de Slanetz-Bartley suplementadas com antibiótico (vancomicina) para o isolamento de enterococos. Foram pesquisados, através da PCR, os genes vanA, vanB, vanC1 e vanC2, genes estes que conferem resistência à vancomicina, para os isolados que apresentaram resistência ou baixa susceptibilidade aos glicopéptidos. Foram também estudados outros genes que conferem resistência a outros antibióticos, designadamente, tet(M) e tet(L) que codificam resistência à tetraciclina; erm(B) à eritromicina; aph(3´)-IIIa à canamicina; vat(E) e vat(D) à quinupristina-dalfopristina; e o ant(6)-Ia à estreptomicina. De 118 amostras fecais, isolaram-se 15 VRE´s (14,85%), a partir de meios de cultura suplementado com antibiótico, sendo 13 Enterococcus faecium e dois E. gallinarum. Todos os isolados apresentaram resistência à vancomicina, teicoplanina e tetraciclina; nove (60,00%) foram resistentes à eritromicina; oito (53,33%) à quinupristina-dalfopristina; sete (46,67%) à ampicilina; cinco (33,33%) à canamicina e dois (13,33%) ao cloranfenicol, assim como à estreptomicina. Dos quinze isolados resistentes à tetraciclina, catorze apresentaram os genes tet(L) e/ou tet(M); todos os nove isolados resistentes a eritromicina exibiram o gene erm(B); quanto à quinupristinadalfopristina, dos oito isolados (sete E. faecium e um E. gallinarum) resistentes a este antibiótico, todos possuíam o gene vat(E); por fim, dos 15 isolados resistentes à vancomicina, 13 apresentaram o gene vanA, e dois apresentaram o gene vanC1. A presença de transposões foi estudada nos 15 isolados VRE, pois todos manifestaram resistência à tetraciclina. Assim, foi detectado o Tn916 em dois isolados e num isolado foi detectado o transposão Tn5397. Outro dos objectivos deste trabalho foi o estudo dos fenótipos e genótipos de resistência a antibióticos (cloranfenicol, vancomicina, quinupristina-dalfopristina,teicoplanina, tetraciclina, ciprofloxacina, ampicilina, eritromicina, estreptomicina, gentamicina e canamicina) em estirpes de Enterococcus spp., isolados a partir de meios de cultura sem suplemento de antibiótico. Assim, de 118 amostras fecais isolaram-se 101 enterococos (53 E. faecium, 41 E. faecalis, 4 E. hirae e 3 E. durans). O antibiótico a que os isolados manifestaram mais resistência foi a tetraciclina (28,71%), seguindo-se a eritromicina (21,78%). As restantes percentagens de resistência ficaram abaixo dos 10% e nenhum isolado mostrou resistência à vancomicina e à teicoplanina. Foram detectados os genes tet(M) e/ou tet(L) em 26 dos 29 isolados resistentes à tetraciclina; dos 22 isolados resistentes à eritromicina, 17 possuíam o gene erm(B); os nove isolados resistentes à canamicina apresentaram o gene aph(3’)-IIIa; os quatro isolados que manifestaram resistência à gentamicina apresentaram o gene aac(6´)-aph(2’’); dos dez isolados resistentes ao cloranfenicol, apenas três possuíam o gene catA; os cinco isolados (quatro E. faecium e um E. durans) resistentes à quinupristina-dalfopristina exibiram o gene vat(E); por fim, dos nove isolados resistentes à estreptomicina, cinco apresentaram o gene ant(6)-Ia. Os 29 isolados que manifestaram resistência à tetraciclina foram igualmente analisados por PCR, para estudo da presença das transposões Tn916 e/ou Tn5397, detectamos isoladamente o Tn916 em 14 isolados. Para finalizar, o último objectivo deste trabalho foi pesquisar a presença de genes codificadores de factores de virulência (hyl, cyl, gel, fsr, cylB, e cylA) nos isolados VRE. Foram apenas detectados quatro isolados possuidores do gene hyl, sendo todos da espécie E. faecium. Deste modo, com a realização deste trabalho foi possível observar os níveis de colonização por enterococos resistentes à vancomicina (vanA) no tracto gastrointestinal de crianças saudáveis, o que constitui um potencial reservatório de genes de resistência. Por outro lado, observaram-se resistências a distintos antibióticos, bem como genes codificadores dessas resistências em estirpes de enterococos isoladas a partir de meios de cultura sem suplemento de antibiótico. É perceptível, através dos resultados deste trabalho, que há ainda um longo caminho a percorrer no combate à multirresistência das bactérias aos antibióticos. Esperamos que, com este estudo, os profissionais de saúde e a comunidade em geral fiquem alertados para o perigo do uso abusivo de antibióticos e que este trabalho sirva de incentivo a todos os investigadores para que no futuro muitos mais estudosdeste tipo venham a ser realizados.The problem of antibiotics bacterial resistance has been an increasing concern in public health. The excessive and irresponsible use of antibiotics is largely responsible for this situation, making a serious problem and leading to a several increase of multidrug resistance. The main objective of this work was the study of antibiotic resistance and virulence factors in commensal strains of Enterococcus spp. of healthy children aged between one and 14 years old. This work was developed in the University of Trás-os-Montes e Alto Douro in a cooperation between the Centre of Studies of Animal and Veterinary Sciences, the Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centre of Genetics and Biotechnology and Hospital of Trás-os-Montes and Alto Douro. One hundred eighteen faecal samples of healthy children were recovered in Portugal during October 2007 and February 2008 and were analyzed for vancomycinresistant enterococci (VRE). vanA-containing E. faecium isolates were detected in 13 of the 118 children samples and vanC1 isolates were found in two. All the isolates showed resistance to vancomycin, teicoplanin and tetracyclina; nine (60.00%) were resistant to erythromycin; eight (53.33%) to quinupristin-dalfopristin; seven (46.67%) to ampicillin; five (33.33%) to kanamycin and two (13.33%) to chloramphenicol and streptomycin too. A diversity of resistance genes [(tet(M), tet(L), erm(B), aph(3’)-IIIa, ant(6)-Ia, catA, and vat(E)] were found in VRE isolates. The presence of transposons has been studied in the 15 VRE isolates, because all showed resistance to tetracycline. Thus, the Tn916 was detected in two isolates and in one isolate was detected the transposon Tn5397. Relatively to presene of genes enconders virulence factors (hyl, cyl, gel, fsr, cylB, e cylA) in VRE isolates, were detected in four isolates E. faecium the gene hyl. Faecal samples of healthy children were seeded, additionally, on Slanetz-Bartley plates and 101 enterococos isolates were recovered. The enterococci isolates were distributed by the followed species: 53 E. faecium; 41 E. faecalis; 4 E. hirae and 3 E. durans. The susceptibility to 11 antimicrobial agents was tested in these isolates; more than ¼ of the isolates (28.7%) were tetracycline resistant; 21.8% were erythromycin resistant and 7.9% were kanamycin resistant. The following resistant genes were detected: aph(3)´-IIIa (in all kanamycin-resistant isolates), aac(6´) (in all gentamycinresistant isolates), tet(M) and/or tet(L) (26 of 29 tetracycline-resistant isolates), erm(B) (17 of 22 erythromycin-resistant isolates). The 29 isolates that expressed resistance to tetracycline were also analyzed by PCR to study the presence of transposons Tn916 and/or Tn5397, and the Tn916 was found alone in 14 isolates. Thus, with this work was possible noted the levels of colonization by enterococci resistant to vancomycin (vanA) in the gastrointestinal tract of healthy children and that constitutes a reservoir of antimicrobial resistance genes. Furthermore,there was resistance to different antibiotics, and genes encoding such resistance in strains of enterococci isolated from the culture medium without antibiotic supplement.It is perceived by the results of this work, there is still a long way to go to combat multidrug resistance of bacteria to antibiotics. We hope that with this study, health professionals and the wider community are alerted to the danger of misuse of antibiotics and that this work will serve to encourage all researchers to ensure that in future many more such studies will be conducted