Wiederherstellen einer gewebeartigen Funktionalität in humanen CD8 T-Zellen des Blutes: mechanistische Studien und Anwendung beim Immunomonitoring von Krebspatienten

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are the only source of human lymphoid cells routinely available for immunologic research and for immunomonitoring of T-cell responses to microbial and tumor-associated antigens. However the large majority of human T-cells resides in tissues, especially in lymphatic organs, while only 1 % of the body’s T-cells circulate in the blood stream. Previous work in mice and humans had indicated that CD4 T-cells transiently lose antigen sensitivity when cellular contacts are lost, e.g. by leaving lymphoid organs such as lymph nodes (LNs) and entering the circulation. In this study, these findings were extended to CD8 T-cells. Thus, CD8 T-cell responses of the human tonsil show a significant drop in sensitivity to viral antigens if tissue-exit was simulated by keeping cells in dispersed culture at body temperature for two hours. Conversely, tissue-like functionality in blood-derived CD8 T-cells was restored by applying the simple and robust RESTORE protocol. Indeed, application of the RESTORE protocol, i.e. pre-culturing PBMCs for two days at a high cell density before initiation of antigenic stimulation, demonstrated that CD8 T-cell responses to a broad range of viral and to tumor-associated antigens are greatly underestimated, and sometimes even remain undetected if conventional, unprocessed PBMC cultures are used. The latter finding is particularly striking with regard to the appearance of Wilms tumor 1 (WT1)-specific CD8 T-cell responses in leukemia patients after allogeneic bone marrow transplantation. My studies on the mechanism of the RESTORE protocol show that HD preculture of PBMCs does not involve antigen-or cytokine-driven clonal expansion of T-cells. Moreover, the gain in antigen sensitivity cannot be explained by a decreased activity of regulatory T-cells during the preculture step. The increased antigen sensitivity of CD8 T-cells from HD precultures of PBMCs is associated with tonic T-cell receptor signaling as indicated by enhanced tyrosine phosphorylation of the CD3 ζ chains and the tyrosine kinase Lck, thereby preparing T-cells for full responses. The upregulation of genes involved in aerobic glycolysis in “restored” CD8 memory T-cells relative to fresh cells might be an essential requirement for increased T-cell functionality including the regulation of IFN-γ production. Taken together, the RESTORE protocol, which was initially described for the CD4 T-cell response to the antibody TGN1412 permits a more meaningful monitoring of CD8 T-cell responses to viral infections and tumors. Furthermore, when generating T-cell lines for adoptive T-cell therapy, the RESTORE protocol allows the generation of CD8 T-cell lines with an improved representation of clones responding to low antigen concentrations.Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs: peripheral blood mononuclear cells) stellen die einzige routinemäßig zugängliche Quelle für humane Lymphozyten dar, welche für die immunologische Forschung und das „Immunomonitoring“ von T-Zellantworten gegen mikrobielle und Tumor-assoziierte Antigene verwendet werden. Jedoch befindet sich der Großteil der T-Zellen des Menschen in Geweben, insbesondere den lymphatischen Organen, wohingegen sich nur 1 % der T-Zellen im Blut aufhalten. Frühere Studien, die sowohl mit murinen als auch mit humanen Zellen durchgeführt wurden, zeigten, dass CD4 T-Zellen ihre Sensitivität gegenüber Antigenen zeitweise verlieren sobald zelluläre Kontakte unterbrochen werden. Dies erfolgt beispielsweise beim Verlassen der T-Zellen von Geweben und dem Eintreten in die Blutzirkulation. In dieser Arbeit wurden diese Beobachtungen auf CD8 T-Zellen ausgeweitet. So weisen humane tonsilläre CD8 T-Zellen eine signifikant niedrigere Sensitivität gegenüber viralen Antigenen auf, wenn diese in Dispersion bei Körpertemperatur für zwei Stunden gehalten werden, um das Verlassen von Geweben und somit den Verlust von zellulären Kontakten zu simulieren. Im Gegenzug konnte eine gewebeähnliche T-Zellfunktionalität bei Blutzellen durch Anwendung des RESTORE Protokolls wiederhergestellt werden. In der Tat zeigte die Anwendung des RESTORE Protokolls, welches eine Vorkultur von PBMCs für zwei Tage bei hoher Zelldichte vor antigenspezifischer T-Zellstimulation einschließt, dass CD8 T-Zellantworten gegen eine Vielzahl viraler und Tumor-assoziierter Antigene deutlich unterschätzt werden, wenn herkömmliche Stimulationsansätze verwendet werden. Teilweise können diese so gemessenen T-Zellantworten bei Verwendung herkömmliche Stimulationsansätze auch gar nicht nachgewiesen werden. Dieser Effekt war bei der Detektion von Wilms Tumor 1 (WT1)-spezifischen CD8 T-Zellantworten bei Leukämiepatienten nach allogener Stammzelltransplantation besonders deutlich zu beobachten. Meine mechanistischen Studien zeigten, dass die Vorkultur von PBMCs bei hoher Zelldichte selbst nicht zu einer Antigen- oder Zytokin-getriebenen T-Zell Expansion führt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der RESTORE Effekt durch den Zugewinn an CD8 T-Zellsensitivität erklärt werden kann und nicht auf eine verringerte CD8 T-Zellsuppression durch regulatorische T-Zellen während der Vorkultur zurückzuführen ist. Die erhöhte Antigensensitivität von vorkultivierten CD8 T-Zellen steht im Zusammenhang mit tonischer T-Zell Signalweiterleitung, welche anhand von erhöhter Tyrosin Phosphorylierung der CD3 ζ Ketten des T-Zell-Rezeptors und der Tyrosinkinase Lck nachgewiesen werden kann. Diese tonischen T-Zellsignale bereiten CD8 T-Zellen darauf vor, bereits auf kleine Mengen Antigen effektiv zu reagieren. Auch die Hochregulierung von Genen, welche der aeroben Glykolyse zuzuordnen sind in vorkultivierten CD8 Gedächtniszellen im Vergleich zu CD8 Gedächtniszellen, welche direkt aus dem Blut isoliert wurden, trägt zu einer erhöhten T-Zellfunktionalität bei, welche die Regulation der IFN-γ Produktion einschließt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung des RESTORE Protokolls, welches ursprünglich zum Nachweis von CD4 T-Zellantworten gegen den Antikörper TGN1412 entwickelt wurde, eine verlässliche Methode zum Nachweis von CD8 T-Zellantworten gegen virale Infektionen und Tumore darstellt. Des Weiteren kann das RESTORE Protokoll zur Generierung von T-Zelllinien in der adoptive T-Zelltherapie eingesetzt werden. Die Anwendung des Protokolls erlaubt das Generieren von Zelllinien, welche auch T-Zellklone beinhalten, die durch Immunantworten auf geringe Antigenkonzentrationen entstanden sind