Identification and Isolation of Aspergillus fumigatus specific T-cellreceptors and functional characterisation after Transfer on human T-cells

Der humanpathogene Pilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) kann in immunsupprimierten Patienten zum Teil schwere invasive Infektionen auslösen. Trotz Fortschritten in den Behandlungsmöglichkeiten und der medikamentöser Prophylaxe bleibt die Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen hoch. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von spezifischeren Immuntherapien von Nöten. Ein Ansatz ist die genetische Modifikation von T Zellen, durch den Transfer von A. fumigatus spezifischen T Zell Rezeptoren (TCRs), für eine adoptive Therapie. Um dieses Konzept zu evaluieren wurden TCRs, die für die extrazellulären Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) spezifisch sind, auf primäre T Zellen transferiert und die Effektor-Funktion analysiert. Das Crf1/p41 Epitop induziert bei gesunden Spendern eine funktionelle TH1 Immunantwort gegen A. fumigatus und führt zur Produktion hoher Mengen von Interferon γ (IFN-γ). Für die Identifikation von A. fumigatus spezifischen TCRs wurden siebenunddreißig Crf1/p41 spezifische T Zellklone von drei HLA DRB1*04 Spendern generiert. Anschließend wurden die TCR β Ketten über die sehr variable komplementaritätsbestimmende Region 3 (CDR3) bestimmt. Es konnten zwölf unterschiedliche TCRs ermittelt werden, von denen vor allem die variablen β (Vβ) Kette 18 sehr dominant, während die Vβ Ketten 1 und 6 nur in wenigen Klonen vertreten waren. Zur weiteren Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden die variablen α (Vα) Ketten bestimmt (Vα 3, Vα 15 und Vα 26). Somit liegt eine polyklonale T Zell Immunantwort vor. Anschließend wurden die Crf1/p41 spezifischen TCRs in den retroviralen Vektor pMP71 kloniert und auf Jurkat 76 Zellen, welche keinen endogenen TCR exprimieren, und auf primäre CD4+ T Zellen transferiert. Die Expression von Crf1/p41 spezifischen TCRs, transduziert in CD4+ T Zellen, zeigten spenderspezifische Unterschiede und die Expression war niedriger im Vergleich zu den transduzierten Jurkat 76 Zellen. Daher wurde auf Optimierungsstrategien zurückgegriffen, die für den adoptiven Transfer mit TCR-modifizierten T Zellen zur Behandlung von Krebs entwickelt wurden. Angewandt wurden die Codonoptimierung der TCR codierenden Sequenz, Murinisierung der TCR konstanter Ketten, Induktion einer weiteren Disulfidbrücke. Ebenfalls wurde das Vektorsystem optimiert. Der Optimierungsprozess der Crf1/p41 spezifischen TCR 1 führte zu einer erhöhten Oberflächenexpression des TCR sowohl in Jurkat 76 (3 bis 5fach) als auch in primären CD4+ T Zellen (2fach). In funktionellen Analysen wurde die Proliferationsfähigkeit und IFN-γ Produktion, durch die Stimulation von transduzierten CD4+ T Zellen (TCR 1 optimiert) mit Crf1/p41 beladenen dendritischen Zellen (DCs), bestätigt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transfer von A. fumigatus spezifischen TCRs eine protektive anti-fungale Immunantwort fördern könnte. Demzufolge auch als ein geeignetes Mittel in einer potentiellen Immuntherapie gegen A. fumigatus Infektionen in immunsupprimierten Patienten, eingesetzt werden könnte.The human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) can cause severe invasive infections in immunosuppressed patients. Despite progresses in the treatment and prophylaxis of invasive infections the mortality rate remains high. On that account the development of a more specific immune therapy seems necessary. One approach is genetic modification of T cells by transfer of A. fumigatus specific T cell receptors (TCR) for an adoptive therapy. To evaluate this concept, TCRs specific for a peptide derived from extracellular cell wall glucanase Crf1 (Crf1/p41) were transferred to primary T cells. Than their effector function was analyzed. In healthy donors the epitope Crf1/p41 induces a functional TH1 immune response towards A. fumigatus combined with a high Interferon-γ (IFN-γ) production. To identify A. fumigatus specific TCRs, thirty-seven Crf1/p41 specific T cell clones were generated from three HLA-DRB1*04 positive healthy donors. Afterwards, the TCR β chains were analyzed by sequencing the most variable complementarity determining region 3 (CDR3). Twelve different TCRs were detected whereas variable β (Vβ) 18 was very dominant, and Vβ 1 and Vβ 6 were present only in some clones. For further characterization of Crf1/p41 specific TCRs, variable α (Vα) chains were identified (Vα 3, Vα 15 and Vα 26). Thus, the T cell response is polyclonal. Subsequently Crf1/p41 specific TCRs were cloned into the retroviral vector pMP71 and transduced into Jurkat 76 cells that lack the expression of endogenous TCR, and into primary CD4+ T cells. The expression of Crf1/p41 specific TCR transduced in CD4+ T cells was donor-dependent and the expression was lower compared to transduced Jurkat 76 cells. Consequently, optimizing strategies engineered for TCR-modified adoptive T cell transfer in cancer therapy were used to induce a higher TCR expression on T cells. Those strategies include codon-optimization of the TCR coding sequence, murinization of constant chains of TCR, induction of an additional disulfide bond. Additionally the vector system was optimized. The optimization process of Crf1/p41 TCR 1 led to a higher surface expression in Jurkat 76 (3-5x) and primary CD4+ T cells (2x). Functional analyses revealed proliferation and IFN-γ production after the stimulation of transduced CD4+ T cells (TCR 1 optimiert) with Crf1/p41 pulsed mature dendritic cells (mDC). These data suggest that the transfer of A. fumigatus specific TCRs might foster protective anti-fungal immune responses. Therefore this might be a suitable tool for immunotherapeutic use against A. fumigatus infections in immunosuppressed patients