Establishing and evaluating processes in molecular biology to identify defined genetic modifications in patients with haematologic diseases

Ziel dieser Arbeit war es, unter Etablierung und Evaluierung der hier verwendeten RNA-Extraktionsmethoden sowie der oben beschriebenen PCR-Verfahren zum Nachweise der genannten Mutationen, eine Verbesserung der molekularen hämatologisch-onkologischen Diagnostik der Universitätsklinik Würzburg zu erreichen, gemessen am Patientenaufkommen der Klinik. Beim Vergleich der verschiedenen RNA-Extraktionsmethoden fällt eine Festlegung auf eine der Methoden schwer. Bisher wurde das hier mitgetestete Kit von Quiagen verwendet. Aufgrund der relativ kurzen Arbeitszeit, die bei der Verwendung dieses Kits benötigt wird, und dem hohen Probenaufkommen in einem Labor dieser Größe ist das Quiagen-Kit sicher eine gute Wahl. Unter dem finanziellen Aspekt gesehen, könnte man aber deutliche Einsparungen erreichen, wenn man zum günstigeren Konkurrenten Macherey-Nagel wechselt. Um hierbei eindeutige Ergebnisse zu erzielen, ist aber eine große Versuchsreihe notwendig, in der Materialkosten gegen Arbeitskosten aufgestellt werden sollten. Die Trizol-Methode ist zwar bei weitem die günstigste Variante in Bezug auf die Materialkosten, aber der Arbeitsaufwand sowie die wenig zufriedenstellenden Reinheitsergebnisse wirken sich doch sehr nachteilig aus. Zum Empfehlen wäre daher für die Uniklinik eine Versuchsreihe mit den kommerziellen Kits, mit großen Probenzahlen und in Verbindung mit nachgeschalteten Mutationsnachweisen für epidemiologisch häufig vorkommenden Mutationen, für die bereits Nachweisverfahren beschrieben sind. Mit den weiteren hier beschriebenen Assays wurden Versuchsreihen durch-geführt, für die es in der Klinik ein geringeres Patientenaufkommen gibt. Es handelte sich hierbei um bestimmte Unterformen der akuten myeloischen sowie der chronisch lymphatischen Leukämie, die insgesamt sehr selten auftreten. Untersucht wurden im Rahmen dieser Arbeit ein Polymorphismus im CD38-Gen, die NPM1-Mutation im Nucleophosmin-Gen sowie die Mutation FLT3-TKD an Position D835 der FLT3-Tyrosinkinase. Der Nachweis des Polymorphismus im CD38-Gen konnte mittels der Restriktionsendonuklease Pvu II und Agarosegelelektrophorese problemlos und reproduzierbar dargestellt werden. Insgesamt ist der CD38-Polymorphismus aber auch in der gesunden Bevölkerung sehr häufig und konnte auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit bei vielen gesunden Probanden nachgewiesen werden. In Zusammenhang mit den Ergebnissen der Literaturrecherche gesehen, ist diese Art des CD38-Nachweises zwar einfach und schnell durchführbar, aber leider ohne Aussagekraft für die Prognose der CLL. Die Nucleophosmin-Mutation Subtyp A mit der Insertion TCTG an Position 956 konnte mittels RT-PCR und anschließender Schmelzkurvenanalyse nach-gewiesen werden. Im untersuchten Patientengut befand sich kein positiver Patient, sodass der Nachweis nur aus einer NPM1-positiven Zellkultur erbracht werden konnte. Da der Nachweis der Mutation bei Patienten mit unverändertem Karyotyp prognostisch günstig ist und insgesamt etwa 35% der AML-Patienten betroffen sind, ist eine Aufnahme dieses Assays in die klinische Routinediagnostik durchaus sinnvoll, um eine individuelle Therapie zu ermöglichen. Der Nachweis sollte in der diagnostischen Kette am besten in die Untersuchung des ersten Knochenmarkspunktates geschaltet werden, sobald ein normaler Karyotyp festgestellt wurde. Ein weiteres Argument für die Einführung in die klinische Routine ist die Nutzung des Versuchs zur Kontrolle der MRD, da ein erneuter NPM1-Nachweis sofort zur Therapieeinleitung führen kann. Anders gestaltet sich der Nachweis der Mutation FLT3-TKD an Position D835 der FLT3-Tyrosinkinase, da sie nur etwa 6-7% aller FLT3-Mutationen darstellt. Das erklärt, warum keiner der hier getesteten AML-Patienten positiv für diese Mutation war. Zudem ist die Mutation nur im Knochenmark aufgrund der höheren Blastenzahlen vor Therapiebeginn eindeutig nachweisbar. Die Aufnahme dieser diagnostischen Möglichkeit in die Routinediagnostik ist also nur dann sinnvoll, wenn sie im Rahmen der AML-Erstdiagnostik bei der ersten Knochenmarkspunktion durchgeführt wird. Wichtiger wäre aber, einen Nachweis für die deutlich häufiger vorkommende FLT3-ITD-Mutation zu etablieren.In the following paper we compared different methods of extraction for human RNA out of leucozytes. We established and evaluated essays to detect the polymorphism in the CD 38 gene by a and described ist role in the transformation of CLL to Richter Syndrome which is an important prognostic factor. Furthdermore we establishes rt-pcr essays to detect mutations in the NPM1 gene and the FLT3 gene and described their importance in the prognosis and specialised therapie of AML