Inhibition of Myc function using small molecule inhibitors of the E3 ubiquitin ligase Huwe1

Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein zentraler Mechanismus in der kolorektalen Karzinogenese. Die Myc-Deletion in Tumormodellen hemmt das Wachstum von Kolonkarzinomen, somit stellt die Inaktivierung von Myc einen Ansatzpunkt in der Behandlung von kolorektalen Tumoren dar. Die direkte Inhibition von Myc ist schwierig, da Myc keine katalytische Aktivität besitzt und stattdessen für die Myc-Funktion nötige Protein-Protein- oder Protein-DNA-Interaktionen angegriffen werden müssen. Die E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 interagiert sowohl mit Myc als auch mit dem Myc-interagierenden Protein Miz1 und ist im Kolonkarzinom überexprimiert. Huwe1 ubiquitiniert Myc und induziert darüber dessen Transaktivierungsfunktion. Die Inaktivierung von Huwe1 ist somit eine vielversprechende Möglichkeit für die Inhibition der Myc-Funktion und die Therapie des Kolonkarzinoms. In dieser Arbeit wird mittels shRNA-vermittelter Depletion von Huwe1 in Zellkulturexperimenten gezeigt, dass Huwe1 für die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien und für die Transaktivierung von Myc-Zielgenen benötigt wird. Mit zwei von Boehringer Ingelheim identifizierten niedermolekularen Huwe1-Inhibitoren (BI8622 und BI8626) ist es möglich, die Huwe1-Funktion spezifisch in Zellen zu blockieren. Die Huwe1-Inhibitoren induzieren einen Proliferationsarrest in kolorektalen Karzinomzelllinien, wohingegen die Substanzen auf embryonale Stammzellen keine Auswirkungen haben. Die Inaktivierung von Huwe1 führt zu einer Akkumulation von Miz1 an Promotoren Myc-aktivierter Zielgene und darüber zu einer vermehrten Bildung repressiver Myc/Miz1-Komplexe, was mit einer Deacetylierung von Histon H3 und einer transkriptionellen Repression Myc-gebundener Gene assoziiert ist. Miz1 akkumuliert nach Huwe1-Inhibition ebenso an direkten Miz1-Zielgenen, deren Expression bleibt aber unbeeinflusst. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine kontinuierliche Degradierung von Miz1 durch Huwe1 zur Transaktivierung von Myc-Zielgenen in Kolonkarzinomzellen nötig ist. Damit wurde ein neuer Mechanismus identifiziert, über den Huwe1 die Myc-Transaktivierung reguliert und der eine tumorzellspezifische Repression der Myc-Funktion mit Hilfe von Huwe1-Inhibitoren ermöglicht.Deregulation of the transcription factor Myc is a central driver in colorectal carcinogenesis. Deletion of Myc in murine tumor models inhibits the growth of colon carcinoma, therefore inactivation of Myc is an attractive possibility for treating these types of malignancies. Since Myc does not contain any catalytic activity, protein-protein or protein-DNA interactions necessary for Myc function need to be modified, making direct targeting of Myc difficult. The E3 ubiquitin ligase Huwe1 interacts both with Myc and the Myc-interacting protein Miz1 and is overexpressed in colorectal cancer. Huwe1 ubiquitinates Myc thereby inducing its transactivation function. Hence, inactivation of Huwe1 is a reasonable approach for inhibition of Myc function and treatment of colon cancer. In this work depletion of Huwe1 via shRNA shows that Huwe1 is required for the proliferation of colon carcinoma cell lines and for transactivation of Myc target genes. Two novel small molecule inhibitors of Huwe1 (BI8622 and BI8626), which were identified by Boehringer Ingelheim, block Huwe1 function in cells specifically. The Huwe1 inhibitors induce a proliferation arrest in colorectal cancer cell lines, but not in embryonic stem cells. Inactivation of Huwe1 leads to an accumulation of Miz1 at promoters of Myc-activated target genes and to an increased formation of repressive Myc/Miz1 complexes at these sites. This is associated with deacetylation of histone H3 and transcriptional repression of Myc-bound genes. Additionally, Miz1 accumulates at direct Miz1 target genes upon Huwe1 inhibition but this does not influence expression of these genes. These data suggest that a continuous degradation of Miz1 by Huwe1 is required for transcriptional activation of Myc target genes in colon cancer cells. This identified a new principle how Huwe1 regulates Myc transactivation allowing a tumor cell-specific repression of Myc function via small molecule inhibitors of Huwe1