Vaccini-Virus-vermittelte Therapie solider Tumoren: Intra-tumoraler Transport therapeutischer Antikörper

Over the past 30 years, much effort and financial support have been invested in the fight against cancer, yet cancer still represents the leading cause of death in the world. Conventional therapies for treatment of cancer are predominantly directed against tumor cells. Recently however, new treatments options have paid more attention to exploiting the advantage of targeting the tumor stroma instead. Vaccinia virus (VACV) has played an important role in human medicine since the 18th century as a vaccination against smallpox. In our laboratory, the recombinant, replication-competent vaccinia virus, GLV-1h68, was shown to enter, colonize and destroy cancer cells both in cell culture, and in vivo, in xenograft models (Zhang, Yu et al. 2007). In addition, combined therapy of GLV-1h68 and anti-VEGF immunotherapy significantly enhanced antitumor therapy in vivo (Frentzen, Yu et al. 2009). In this study, we constructed several new recombinant VACVs carrying genes encoding different antibodies against fibroblast activation protein (FAP) in stroma (GLV-1h282), nanobody against the extracellular domain of epidermal growth factor receptor (EGFR, GLV-1h442) or antibodies targeting both vascular endothelial growth factor (VEGF) and EGFR (GLV-1h444) or targeting both VEGF and FAP (GLV-1h446). The expression of the recombinant proteins was first verified using protein analytical methods, SDS-gel electrophoresis, Western blot analysis, immunoprecipitation (IP) assays and ELISA assays. The proteins were detected after infection of the cells with the different VACVs and the recombinant proteins purified by affinity adsorption. The purified antibodies were shown to specifically bind to their respective antigens. Secondly, the infection and replication capability of all the virus strains was analyzed in cell culture using several human tumor cell lines (A549, FaDu or DU145), revealing that all the new recombinant VACVs were able to infect cancer cells with comparable efficiency to the parental viruses from which they were derived. Thirdly, the antitumor efficacy of the new recombinant VACVs was evaluated in vivo using several human cancer xenograft models in mice. In A549 and DU145 xenografts, the new recombinant VACVs exhibited an enhanced therapeutic efficacy compared to GLV-1h68 with no change in toxicity in mice. In the FaDu xenograft, treatment with GLV-1h282 (anti-FAP) significantly slowed down the speed of tumor growth compared to GLV-1h68. Additionally, treatment with the recombinant VACVs expressed the various antibodies achieved comparable or superior therapeutic effects compared to treatment with a combination of GLV-1h68 and the commercial therapeutic antibodies, Avastin, Erbitux or both. Next, the virus distribution in tumors and organs of treated mice was evaluated. For most of the viruses, the virus titer in tumors was not signficantly diffferent than GLV-1h68. However, for animals treated with GLV-1h282, the virus titer in tumors was significantly higher than with GLV-1h68. This may be the reason for enhanced antitumor efficacy of GLV-1h282 in vivo. Lastly, the underlying mechanisms of therapeutic antibody-enhanced antitumor effects were investigated by immunohistochemistry. Blood vessels density and cell proliferation in tumors were suppressed after treatment with the antibody-encoded VACVs. The results indicated that the suppression of angiogenesis or cell proliferation in tumors may cause the observed therapeutic effect. In conclusion, the results of the studies presented here support the hypothesis that the treatment of solid tumors with a combination of oncolytic virotherapy and immunotherapy has an additive effect over each treatment alone. Moreover, expression of the immunotherapeutic antibody by the oncolytic VACV locally in the tumor enhances the antitumor effect over systemic treatment with the same antibody. Combined, these results indicate that therapy with oncolytic VACVs expressing-therapeutic antibodies may be a promising approach for the treatment of cancer.In den letzten 30 Jahren wurde viel Aufwand und finanzielle Unterstützung in den Kampf gegen Krebs investiert, doch das Resultat ist limitiert, da Krebs immer noch die zweithöchste Todesursache in der Welt darstellt. Zusätzlich zu gegenwärtig verwendeten Therapien, die vorwiegend gegen Tumorzellen gerichtet sind, wird neuen Therapien mehr Aufmerksamkeit gewidmet, die stattdessen direkt auf das Tumorstroma zielen. Onkolytische Vaccinia Viren haben seit dem 18ten Jahrhundert als Impfstoff gegen Pocken in der Humanmedizin eine wichtige Rolle gespielt. In unserem Labor hat das rekombinante, replikationskompetente Vaccinia Virus GLV-1h68 gezeigt, dass es in Zellkultur und in Xenograft Modellen in Krebszellen eindringen sowie diese kolonisieren und zerstören kann (Zhang, Yu et al. 2007). Zusätzlich verbessert die kombinierte Therapie von GLV-1h68 und anti-VEGF Immunotherapy signifikant die Antitumortherapie in vivo (Frentzen, Yu et al. 2009). In dieser Studie haben wir mehrere neue rekombinante VACVs konstruiert, die die Gene für verschiedene Antikörper gegen das Fibroblasten Aktivierungs Protein (FAP) im Stroma (GLV-1h282) oder einen Nanobody gegen die extrazelluläre Domäne des Epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR; GLV-1h442) kodieren. Ausserdem wurden Viren konstruiert, die eine Ko-Expression von Antikörpern gegen sowohl vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) als auch EGFR (GLV-1h444) oder gegen sowohl VEGF als auch FAP (GLV-1h446) erlauben. Zunächst wurden SDS-Gelelektrophorese, Western Blot Analyse, Immunprezipitation (IP) und ELISA Assays durchgeführt, um die Expression der rekombinanten Proteine in Zellen mit proteinanalytischen Methoden zu untersuchen. Die Proteine waren nach Infektion der Zellen mit den verschiedenen VACVs nachweisbar und wurden mittles des FLAG Tags mit einem IP Kit aufgereinigt. Es konnte gezeigt werden, dass die aufgereinigten Antikörper spezifisch an ihr jeweiliges Antigen binden. Zweitens wurde die Infektion und Replikationsfähigkeit aller Virusstämme in Zellkultur untersucht (A549, FaDu oder DU145) und mit ihrem jeweiligen Ausgangsstamm GLV-1h68, GLV-1h164, GLV-1h282 oder GLV-1h442 verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass alle neuen rekombinanten VACVs Zellen mit vergleichbarer Effizienz infizieren konnten wie ihre Ausgangsstämme. Drittens, um die Antitumoreffizienz der neuen rekombinanten Stämme in vivo zu testen, wurden verschiedene humane Tumor Xenotransplantat-tragende Nacktmäuse mit verschiedenen VACVs behandelt. In A549 und DU145 Xenotransplantaten zeigten die neuen rekombinanten VACVs erhöhte therapeutische Effizienz verglichen mit dem Ausgangsstamm GLV-1h68, ohne Veränderung der Toxizität in Mäusen. Im FaDu Xenotransplantat verursachte die Behandlung mit GLV-1h68 keine Tumorregression, wohingegen die Behandlung mit GLV-1h282 (anti-FAP) die Geschwindigkeit des Tumorwachstums signifikant verlangsamte sowie das Überleben verlängerte. Zusätzlich haben wir herausgefunden, dass die Behandlung mit Antikörpern, die mittels Virus geliefert wurden, einen identischen oder sogar erhöhten inhibitorischen Effekt erzielen können, wie in einer Kombinationstherapie von GLV-1h68 und kommerziell erhältlichen Antikörpern, wie Avastin, Erbitux oder beidem. Um die virale Verteilung in vivo zu untersuchen, wurden Tumore und Organe von Mäusen seziert und homogenisiert, gefolgt von Titration der Virusmenge. Die Virus-Titer in Tumoren waren signifikant höher in Tieren, die mit GLV-1h282 behandelt wurden als solche, die mit GLV-1h68 behandelt wurden. Dies mag den Grund für die erhöhte Antitumoreffizienz von GLV-1h282 in vivo darstellen. Die Virus-Titer in allen anderen Gruppen zeigten keinen signifikanten Unterschied. Um den Mechanismus der durch therapeutische Antikörper erhöhten Antitumortherapie zu untersuchen, wurde Immunohistochemie durchgeführt. Nach Behandlung mit den Antikörper-kodierenden VACVs waren die Blutgefäβdichte und Zellproliferation in Tumoren reduziert, nachgewiesen durch die jeweilige CD31 and Ki67 Färbung. Die Resultate deuteten an, dass die Suppression der Angiogenese oder der Zellproliferation in Tumoren den beobachteten Effekt verursachen könnte. Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Daten dass die Kombination der Behandlung von onkolytischer Virotherapie mit Immunotherapie durch Virus-gelieferte Antikörper einen vielversprechenden Ansatz für Krebstherapie darstellt